真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控

真核细胞常见表达载体1.pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。2.pEGFP,增强型绦色荧光蛋白表达载体(EnhancedFluorecentProteinVector)特点:pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。Excitationmaximum=488nm;Emissionmaximum=507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccgctagcgctaccggtcgccaccatg-.EGFP…BamH1…SV40polyA+Nhe1Age13.pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途:pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。Excitationmaximum=488nm;Emissionmaximum=507图示为启动子和多克隆位点区域：pCMV….Nhe1….Age1….EGFP…Bgl11…Actin…BamH1…SV40polyA+4.pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。图示为启动子和多克隆位点区域：Pvu11…pSV40….Hind111….SV40IVS….SV40polyA+5.CMV4表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。图示为启动子和多克隆位点区域：CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1…GH…….SV40ori其他常用克隆Vector：pBluscriptIIKSDNA15ugpUC18DNA25ugpUC19DNA25ug说明:pBluescriptIIkS、pUC18&Puc19载体适合于DNA的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA的载体。此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。保存液:TEBufferTEBuffer组成:10mMTris.HCL(Ph8.0)真核细胞表达外源基因的调控1.真核基因组的复杂性与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。(1)真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍;大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。(2)真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。(3)原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。(4)如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA;真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。(5)原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。(6)原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。(7)原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列(repetitivesequences)。用复性动力学等实验表明有三类重复序列：①高度重复序列(highlyrepetitivesequences)，这类序列一般较短，长10-300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组DNA序列总量的10-60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。②中度重复序列(moderatelyrepetitivesequences)，这类序列多数长100-500bp，重复101-105次，占基因组10-40%。例如哺乳类中含量最多的一种称为Alu的序列，长约300bp，在哺乳类不同种属间相似，在基因组中重复3-×105次，在人的基因组中约占7%，功能也还不很清楚。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成簇重复30-40次，这些基因都可归入中度重复序列范围。③单拷贝序列(singlecopysequences)。这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。从上述可见真核基因组比原核基因组复杂得多，至今人类对真核基因组的认识还很有限，使现在国际上制订的人基因组研究计划(humangeneproject)完成，绘出人全部基因的染色体定位图，测出人基因组109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互关系，特别是要明了基因表达调控的全部规律，还需要经历很长期艰巨的研究过程。2.真核基因表达调控的特点尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。(1)真核基因表达调控的环节更多如前所述，基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内)，翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。图1扼要地列出真核基因表达的各个可能的环节。图1真核生物基因表达调控的可能环节图1总结了以前章节叙述过的基因表达过程，并作了一些新补充。图中标出了真核细胞在分化过程中会发生基因重排(generearrangement)，即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化，与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因，其中就有复杂的基因表达调控机理。此外，真核细胞中还会发生基因扩增(geneamplification)，即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育过程中其rRNA基因(可称为rDNA)可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精后迅速发育分裂要合成大量蛋白质，需要有大量核糖体。又如MTX(methotrexate)是叶酸的结构类似物，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因的DNA区段扩增40?00倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚。(2)真核基因的转录与染色质的结构变化相关真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中NA和组蛋白的结构状态都影响转录，至少有以下现象：1)染色质结构影响基因转录细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质(euchromatin)，松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质(heterochromatin)，其中从未见有基因转录表达;原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达;哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。可见紧密的染色质结构阻止基因表达。真核细胞表达外源基因技术1.生化方法(1)磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞1)转染前24h，通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60mm组织培养皿或12孔板上。于含5%～7%CO2的37℃温箱孵育20～24h。转染前1h换液。2)按照下属方法制备磷酸钙-DNA沉淀：于5ml灭菌塑料管内混合100μl2.5mol/LCaCl2与25μg质粒DNA，如有必要用0.1×TE(pH7.6)将体积补至1ml。室温下将以上2×钙-DNA溶液与等体积的2×HEPES盐溶液混合。迅速弹敲试管侧壁混匀溶液，静置1min。3)立即将磷酸钙-DNA悬液转移至上述单层细胞的细胞培养基中。每1ml培养基加0.1ml悬液。轻轻摇动平皿混匀培养基，培养基会变成混浊的橘黄色。一旦形成DNA沉淀，转染效率会大大降低，因此此步动作应尽可能迅速。如果是用氯喹、甘油与/或丁酸钠处理细胞，直接进行步骤5。4)如果转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5%~7%CO2的37℃温箱孵育。2～6h后，吸去培养基与DNA沉淀。加入5ml37℃预热