真菌荧光原位杂交技术-w

真菌荧光原位杂交技术-吴松松第一步：荧光探针标记。1，利用已知的特异序列送公司合成探针。各种情况的探针均适合，500bp的片段最好用此种方法。2，切口平移法。用DNApolymeraseI和DNaseI。适合较大的片段，一般7kb，1kb的片段效果较差。①1×DNApolymeraseⅠbuffer（1×）5μl②dNTP（10μM）5μl③Bio-11-dUTPorDig-11-dUTP（1mM）1.2μl④DNaseⅠ(0.005U/μl)1μl⑤DNApolymeraseⅠ(coli.10U/μ)1.2μl⑥DNA（2.5μg）Xμl⑦ddH2O36.6-Xμl⑧Total50μl混匀后置于原位PCR或者于水浴锅中15℃4h，然后利用1％的琼脂糖凝胶检测片段大小，在100－500bp左右表示酶切完全，此时可停止反应。另有FISHTag™DNAMulticolorKit中也是切口平移法，但探针标记时需结合荧光染料，步骤比较复杂。3，随机引物法。用随机引物合成探针，此种方法适合cDNA片段为500~1000bp的片段。①500ngDNAXμl②2.5XRandomPrimersSolution:20μl③10XdNTPMixture:5μl④ddH2O24-Xμl⑤KlenowFragment1μl1.冰上操作：cDNA大约500ngDNA（5-20μl）的离心管中加入20μl2.5XRandomPrimersSolution.于沸水中变性5min，立即放于冰上2.将融化的10XdNTPMixture及ddH2O提前放于冰上并依次加入，轻轻混匀。3.加入1μlKlenowFragmen轻轻混匀（剧烈震荡酶易失活），并低速离心30sce。4.37℃孵育60min后加入5μlStopBuffer。5.无水乙醇或异丙醇沉淀（加核酸助沉剂），75%乙醇清洗沉淀并用50μlDEPC-H2O溶解。6.电泳检测探针质量。片段集中在250~500bp质量较好，可用于原位杂交。第二步：样品的处理。1，PDB摇培3~5d的菌丝或者收集的真菌孢子分别用DEPC--H2O和1×PBS清洗一次，8000rpm离心。2，CSKBuffer处理。加入CSKBuffer（0.5%TritonX-100,，10mMVRC或RRI）于4℃处理10~12min。第三步：样品的酶解与固定。1，用4%的多聚甲醛浸泡，于4℃暗处理1-4h。2，挑取菌丝或吸取孢子均匀涂与PE玻片上，风干使样品固定于玻片上。3，用DEPC-treated水洗两次，风干。用1×PBS渗透缓冲液覆盖（1%SDS，1%裂解酶,0.1%蜗牛酶），30°C，10min（实验中发现如果30min，菌丝降解的比较严重，因此可能应该减少酶解时间,15min），用DEPC处理的水冲洗，晾干。然后用50%，80%和100%的乙醇进行脱水处理，每次5min。（参考文献：AlpineStreambyNewTaxon-SpecificInSituDetectionofFreshwaterFungi）.第四步：杂交1，杂交液准备。2×hybridizationbuffer：4×SSC，40%硫酸葡聚糖，2mg/mlBSA，50%甲酰胺。将探针于95~98℃变性5min后立即冰浴3min，以探针终浓度为0.56~5ng/μl的浓度加入冰上预冷的杂交缓冲液中。探针浓度可以降低到2.5ng/ul（经过实验，该浓度的探针还是高，不过没有检测探针的质量，可以先检测探针的质量，200-500bp）。2，50μl体积1片2片4片8片①100%去离子甲酰胺25μl50μl100μl200μl②20×SSC5μl10μl20μl40μl③5%BSA(SS)0.5μl1μl2μl4μl④10×SDS2.5μl5μl10μl20μl⑤50%硫酸葡聚糖10μl20μl40μl80μl混匀，离心，然后加入3，⑥Bio-11-dUTP标记的探针50-100ng/片10μl20μl4，⑦Dig-11-dUTP标记的探针50-100ng/片10μl20μl5，6，杂交。每玻片100~150μl杂交液滴加于样品上，盖膜与46℃暗盒（底部加入浸有2×SSC的吸水纸）中孵育过夜（16~20h）。第五步：杂交后洗脱。1，用2×SSC配制50％的甲酰胺溶液，42℃水浴预热，同时预热两份2×SSC溶液，预热20min以上。2，把玻片从湿盒中拿出，于2×SSC揭膜。3，于预热的甲酰胺中，42℃摇床摇10min，转入预热的2×SSC中摇两次，每次5min。第六步：标抗及结合链霉亲和素。1，地高辛标抗。①室温的2×SSC摇一次，5min。②4×SSC/Tween20(0.2%)摇一次，5min，（配制：1L4×SSC加Tween2ml）。③每片加新鲜的5％BSA（4片配制：0.1gBSA+2ml1×PBS）100μl盖膜，室温放置5min，直接用镊子揭去盖膜。（以后每步避光）④配制anti-digFITC溶液（用5％BSA稀释75倍），每片加100μl，盖膜后湿盒中37℃温育1h。⑤4×SSC/Tween20(0.2%)摇洗3次，每次5min，1×PBS缓冲液中洗1次5min。2，生物素结合链霉亲和素。①1×PBS漂洗一次，5min。②5％的BSA100μl每片，盖膜，室温放置5min,揭膜。③用1：40配置Cy3耦联的链亲和素。每片50μl，盖膜，湿盒37度温育30min④1×PBS洗三次，每次5min第七步：DAPI负染与荧光信号检测1，5μg/ml的DAPI每片100μl。7，盖膜室温放置15min，1×PBS揭膜。8，每片加抗荧光猝灭剂一滴（10μl枪）。3，用干净的盖片盖好，于荧光显微镜下检测。4℃避光保存，完想保留玻片时：2×SSC摇10min,70%乙醇摇3min，100%乙醇摇3min,空气干燥。所需试剂准备20×SSC：0.3Msodiumcitrate,3MNaCl(pH7.0)CSKBuffer：100mMNaCl,300mMsucrose，3mMMgCl2，10mMPIPES(pH6.8)Storeat4°C.1×PBS：NaCl137mM，KCl2.7mM，Na2HPO410mM，KH2PO42mM（pH7.2～7.4）4%多聚甲醛：2g多聚甲醛加入30ml1×PBS中，60℃加热10min后加入少量0.1MNaOH摇匀至多聚甲醛完全溶解后1×PBS定容至50ml。10ml:0.4g多聚甲醛加7ml水，加40ul5MNaOH，在定容至10ml注意事项1、做RNAFISH实验，首先要防止RNA酶的污染。操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换。所有实验用到玻璃制品都要高温灭菌，且各种溶液要用DEPC水配制。2、去污剂tritonX-100处理的目的是增加细胞的通透性，利于杂交探针进入细胞，其处理时间因应不同的细胞而有所不同。注意：过度的去污剂处可能会引起靶核酸的丢失。3、荧光见光就会淬灭，因此操作过程要做好避光。4、实验所用探针是双链DNA探针，而杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。因此在做RNAFISH杂交前，探针必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。5、探针的浓度因其种类和实验要求而有所不同，一般为0.5-5ng/ul。合适的探针浓度要通过实验才能确定。6、杂交反应时，盖玻片不可有气泡，不然妨碍探针与细胞的接触。7、玻片经antifadereagent封片后可在4℃暗处保存2-3星期而不失去全部荧光，但FISH操作完成后要及时观察采图，地高辛标记的隔夜观察效果较好。8、如果镜检时，观察到有非特异结合造成的高背景。可能原因有：不合适的探针量，不适合的杂交后洗涤，又或者是样本中有过多的重复序列。解决方法：1）使用合适的探针量；2）改善杂交后的洗涤，如洗涤液要新鲜配制，增加洗涤液的量，延长洗涤时间等；3）使用DNA阻断剂，在探针中加入一定量的DNA竞争性阻断剂如COT-1DNA或鲑精DNA来竞争性结合基因组中重复性片段。