米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性维生素的测定

米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性维生素的测定（江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡214122）摘要：微波浸提法研究了米糠多糖的提取，HPLC法同时测定了米糠中4种水溶性维生素。料液比为1：8在50％微波火力条件下浸提30min，三氯乙酸去蛋白，两步去淀粉，30％醇沉，米糠多糖得率达1.41%。以体积比为88:12的0.1％磷酸水溶液-甲醇为流动相，以0.6mL/min流速等度洗脱，在266nm波长下检测。各组分在8min能基线分离。米糠中VB1、VB6、烟酸和烟酰胺的含量分别为7.7×10-6g/g、1.3×10-6g/g、14.9×10-6g/g、16.2×10-6g/g。关键词：米糠；多糖；微波浸提；水溶性维生素；高效液相色谱StudyonMicrowaveAssistantExtractionofRiceBranPolysaccharidesandDeterminationofWater-SolubleVitaminsinRiceBranAbstract:Microwaveassistantextractionhasbeenappliedforpolysaccharidesinricebransamples.Thebesttechnologywerethatthematerial-waterratiowas1:8,thetimeofmicrowaveassistantextractionwas30minunder50%firepower.Itwasprovedthatα-amylasecouldwipeoffamylumeffectivelybytwosteps,andtrichloroaceticacidmethodwasthebestwaytowipeoffalbuminoid.Andtheethanolconcentrationwas30%,theextractionrateofthewater-solublepolysaccharidesofricebranwas1.41%.Highperformanceliquidchromatography(HPLC)hasbeenappliedforthesimultaneousdeterminationoffourkindsofwater-solublevitaminsincludingvitaminB1,vitaminB6,nicotinicacid,andnicotinamideinricebran.TheseparationwasperformedonaHypersilC18column(250cm×4.6mmi.d.,5.0μm)withamobilephaseof0.1%H3PO4-methanol(88:12,V/V)atflowrateof0.6mL/min,anddetectionwavelengthwas266nm..Baselineseparationoffourvitaminscanbeachievedwithin8minutes.Thecontentof7.7×10-6g/g、1.3×10-6g/g、14.9×10-6g/g、16.2×10-6g/gforvitaminB1,nicotinicacid,vitaminB6andnicotinamide.Keywords:ricebran;polysaccharides;microwaveassistantextraction;water-solublevitamins;highperformanceliquidchromatography米糠是一类具有广泛开发潜力的高附加值资源，含有稻米的64％营养物质及90％人体所需要的各种营养元素[1]，包括维生素、米糠多糖、氨基酸、脂肪酸、矿物质，还有二十八碳烷醇、神经酰胺等生理功能卓越的活性物质[2]。米糠多糖（RiceBrainpolysaccharide，RBP）存在于稻谷的颖果皮层里，主要是指分子量不等的一类非淀粉多糖。采用不同的提取工艺会得到不同的米糠多糖组分。米糠多糖具有广泛的生理活性，在抗肿瘤，增强免疫力，降血糖，降脂方面有显著效果；水溶性维生素是一类重要的营养成分，在各种保健品[3]，功能型饮料中得到应用。烟酸和烟酰胺能够促进头皮血液循环，防止脱发；VB6具有美发功效；VB1具有滋养与深层清洁的作用，因此化妆品中也常添加微量的维生素[4]。因此，本实验对这两种活性成分进行了研究。多糖提取的方法有微波浸提法，热水蒸煮法，超声波提取法等。实验中考察了米糠多糖的提取方法及去除杂质方法。选取较优的微波提取法，并对其提取工艺参数进行了进一步优化。测定维生素的方法有紫外分光光度法[5]、荧光法[6]和高效液相色谱法（HPLC）[7]。但HPLC技术用于米糠中水溶性维生素的测定还未见报道。实验采用HPLC建立了米糠中的水溶性维生素的测定方法，对样品前处理方法进行了研究，对测定体系各影响因素进行了优化。方法简便快速，准确可靠，对复杂体系中水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。一米糠多糖的提取研究1.米糠多糖的提取1.1实验材料米糠：无锡秦良商贸有限公司耐高温α-淀粉酶：无锡酶制剂厂，20000IU/g试剂：无水乙醇、石油醚、三氯乙酸、盐酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。1.2仪器722型可见光分光光度计；LD4-2A型台式离心机；Panasonic微波炉；真空冷冻干燥机。1.3实验方法1.3.1米糠样品的前处理将米糠用石油醚按1：3比例脱脂1小时，重复3次，自然干燥。1.3.2用改进的硫酸-苯酚法测米糠多糖含量1.3.2.1显色剂的制备将50mL浓硫酸缓缓加入10mL水中，冷却至室温，加入0.6g苯酚晶体搅拌使其溶解配成显色液。1.3.2.2硫酸-苯酚法测米糠多糖含量取1.00mL稀释一定倍数的糖液于试管中加入5.00mL显色液振荡混匀；取1.00mL蒸馏水于试管中加入5.00mL显色液振荡混匀，得到参比溶液。将标准溶液和参比溶液置于沸水浴中保温30~35min，取出后放在冷水浴中冷却至室温，于490nm波长处测定其吸光值。传统的硫酸-苯酚测糖法的操作过程是：取1.00mL样品加1.00mL水，加1.00mL6%苯酚摇匀后再加入5mL浓硫酸，振荡显色，静置30min后，于490nm处检测其吸光度。加入硫酸时系统显色温度相差较大，而造成相应的偶然偏差。而改进后的方法，由于先把水和硫酸混合，对浓硫酸起到了稀释作用，用冰水冷却最后加入苯酚晶体，配成显色液。通过沸水浴加热来使其显色，保证了反应系统温度一致，很好地解决了检测重现性与准确度的问题。1.3.3去除杂质方法的比较在多糖提取的过程中，蛋白与淀粉的去除会影响到多糖的纯度与得率。因此本实验采用50%微波火力浸提30min，重复两次提取。考察了Sevage法与三氯乙酸法去蛋白法；同时也考察了淀粉一步消化法与两步消化法。正交实验见表1。实验结果见图1。Sevage法三氯乙酸法一步消化法两步消化法30%醇沉Ⅰ√√√Ⅱ√√√Ⅲ√√√Ⅳ√√√由此可以看出：淀粉一步消化所得多糖略高于两步消化所得，可能是由于在较短的时间内淀粉未去尽，而淀粉本身就是一种多糖物质，为了得到较纯的米糠多糖，实验优先考虑采用两步消化法；在去蛋白的方法中，比较Ⅱ、Ⅳ得知，采用Sevage法与三氯乙酸法所得米糠多糖含量差别不大，考虑到Sevage法毒性较大，耗时较长，实验优先考虑三氯乙酸法。00.20.40.60.811.21.41.6ⅠⅡⅢⅣ（%）图1正交实验结果1.3.4米糠多糖提取方法选择1.3.4.1微波浸提法脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：10混合置于50％微波火力下浸提30min，冷却，离心得上层液，重复提取两次，合并上层液。在上层液中加入0.5％的耐高温α-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后，再加入0.25％的0.5％的耐高温α-淀粉酶，在相同的条件下保温消化15小时，离心得上清液。用30％的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH＝4.5（即米糠蛋白等电点，pI），置于4oC冰箱中静置过夜，使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。在上述得到的上清液中，加入无水乙醇，使其含量为30％（V/V），置于4oC冰箱中静置过夜，离心，得到米糠粗多糖RBPa溶液。用722型分光光度计测其吸光值，计算米糠多糖含量。1.3.4.2热水蒸煮浸提法脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：10混合置于110oC水浴锅中，使其保持沸腾状态2小时，期间不断搅拌，定时补入损失的水分，冷却，离心得上层液，重复提取两次，合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。1.3.4.3超声波浸提法脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：10混合，在80oC条件下超声提取30min，冷却，离心得上层液，重复提取两次，合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。1.3.5比较结果上述方法均是参考了有关文献报道，采用的提取率相对较高的实验条件。通过722型分光光计对两种糖含量的测定，见图2。可见，微波法不仅在提取时间而且在糖的浸出率方面更具有优势。因此实验采用微波浸提法，并对提取时间，提取火力进行了研究。00.050.10.150.20.250.30.350.40.45微波提取法蒸煮提取法超声提取法糖含量/（%）图23种提取方法所得米糠多糖含量1.3.5微波浸提工艺1.3.5.1微波提取脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：8混合，分别在50％微波火力条件下浸提30min（Ⅰ），50min（Ⅱ）；100％微波火力条件下浸提30min（Ⅲ）、50min（Ⅳ）。冷却，离心。各重复两次提取，合并上层液。1.3.5.2两步消化法去除淀粉在上层液中加入0.5％的耐高温α-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后，再加入0.25％的0.5％的耐高温α-淀粉酶，在相同的条件下保温消化15小时，离心得上清液。1.3.5.3三氯乙酸去除蛋白质用30％的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH值＝4.5（即米糠蛋白等电点，pI），置于4oC冰箱中静置过夜，使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。1.3.5.4乙醇沉淀米糠多糖在上述得到的上清液中，加入无水乙醇，使其含量为30％（V/V），置于4oC冰箱中静置过夜，离心，得到米糠粗多糖RBPa。1.3.5.5不同提取条件下米糠多糖含量比较00.050.10.150.20.25ⅠⅡⅢⅣ米糠多糖含量/（%）图3微波提取4种条件所得米糠多糖含量由图3得知，微波提取条件Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅳ，可见微波火力增大会对多糖造成一定的破坏；提取时间过长也存在同样的情况。当微波辐射时间一定时，微波火力越高，物系吸收微波能越多，物系温度升的越快，固液传质速度亦越快；且温度越高，对物料细胞破坏作用越大，有利于物料有效成分浸出。但当微波火力增加到一定程度时，微波有可能促使米糠多糖分解，反而使米糠多糖提取率下降。1.3.5.6真空冷冻干燥将微波方法Ⅰ所得的米糠多糖RBPa透析48小时后，冷冻干燥得到RBPa的固体粉末。2讨论因此，脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：8混合，三氯乙酸法去除蛋白，两步法去除淀粉，在50％微波火力条件下浸提30min（Ⅰ）为最佳米糠多糖提取方法。米糠得率为1.41％。RBPa为淡黄色絮状固体，无味。苯酚－硫酸试剂反应均呈棕红色，与碘反应不显蓝色；易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮，无甜味，无挥发性，水溶液为浅黄色。二、高效液相色谱法测定米糠中的水溶性维生素1实验部分1.1仪器、试剂与样品仪器：Waters505高效液相色谱仪（包括2487紫外检测器），Empower色谱工作站。色谱柱：HypersilC18（250cm×4.6mmi.d.,5.0μm）。超声波振荡器（BRANSONSB3200－T，上海）；固相萃取柱（固相PT-系列，河北省津杨滤材厂）等。试剂：VB6（纯度≥99％）、烟酰胺（纯度≥99％）、烟酸（纯度≥99.5％）、VB1（纯度≥98％）。均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）；甲醇为色谱纯，水为超