第三章原核生物分子克隆载体

1第三章分子克隆载体§3.1质粒载体质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killerplasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。质粒DNA分子大小：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系：一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。一、质粒的一般特征1.质粒DNA编码的表型质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%，但却编码着重要的遗传性状：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；2.质粒DNA的转移①接合型质粒和非接合型质粒*接合型质粒(conjugativeplasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合型质粒(non-conjugativeplasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。②质粒DNA的转移过程质粒自主转移质粒的辅助转移质粒的重组转移3.质粒DNA的复制类型根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为：2①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的质粒(stringentplasmid)：每个寄主细胞中仅含有1-3份拷贝；②高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的质粒(relaxedplasmid)：每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝。一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对的，它的复制不仅受自身的制约而且还受到寄主的控制4.质粒的不亲和性①定义：是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。注意：只有当有确切的证据表明第二种质粒B已经进入含有A质粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和B是不亲和的质粒。②不亲和群的概念：彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibilitygroup)。彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。同一不亲和群的南粒在亲缘关系上则比较接近，以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不亲和pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不亲和p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不亲和③质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的：*ⅰ.负反馈调节环(negetivefeed-backloop)：大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。当质粒处于低拷贝数和低浓度的阻遏蛋白时，其复制活动更会继续时行。ⅱ.同一个细胞含两种相容质粒，由于亲缘关系远，故它们所产生的阻遏蛋白质就不会互相影响另一个质粒的复制。于是这两种质粒在同一细胞中都保持着自己的正常拷贝数。*ⅲ.同一细胞含两种不相容的质粒，亲缘关系密切，它们所产生的阻遏蛋白质不仅影响自身质粒DNA复制，还会彼此影响对方质粒DNA的复制。这就出现了两种阻遏蛋白质联合调控质粒复制速率。*ⅳ两种不相容质粒往往拷贝数不相当，其中高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的要差一些。因此在复制抑制剂(阻遏蛋白质)浓度低的情况下，高拷贝质粒仍可复制，从而最终使低拷贝质粒被淘汰掉(稀释掉)。二、质粒DNA的复制与拷贝数的控制31．ColE1质粒DNA复制调节的机理许多的质粒载体都是由ColE1质粒派生的。ColE1质粒的复制是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环型DNA单向进行。RNAI和RNAII这两种分子都是由ColE1DNA转录产生的，是控制ColE1质粒复制的两种关键因素。由于这两种RNA分子是根据同一区段DNA的正反链合成的，因此两者的序列是彼此互补的。RNAI是由ColE1质粒的inc基因编码的一种小分子量的RNA分子，它通过干扰RNAII分子的加工而抑制质粒DNA分子的复制。RNAII也是由ColE质粒DNA编码的另一种小分子量的RNA分子，并在复制起点形成RNA-DNA杂交分子。RNase是一种核酸内切酶，它切割RNAII分子释放出3-OH作为DNA聚合酶I催化的DNA复制的引物。所以控制ColE1质粒复制的关键点就是在复制起点形成RNAⅡ-DNA双链分子，而它的关键步骤却是由RNAⅠ控制。ColE1的复制同样也受一种RNA调节剂Rom的控制，它可以使RNAI和RNAIIII之间的碱基配对作用保持稳定，从而阻止RNAⅡ与模板DNA杂交2．质粒复制控制的分子模型目前公认的阐明质粒复制控制机理的分子模型有两个:自体阻遏蛋白质模型:核心是阻遏蛋白质的合成受负反馈调节机理调节。关键论点是：阻遏蛋白质的合成受负反馈机理调节，而且其浓度是恒定的。抑制蛋白质稀释模型:阻遏蛋白质是组成型合成,其浓度同质粒的拷贝数成正比。关键论点是：阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。①抑制蛋白质稀释模型质粒DNA的复制是受一种由质粒编码的抑制蛋白Cop调控的。Cop蛋白质的浓度同质粒的拷贝数成正比。它通过两种途径质粒的复制：一种是通过同质粒DNA的复制起点(ori)结合，直接抑制质粒复制.另一种是通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。一般认为,单体状态的Cop蛋白质是没有活性的，当处于多体状态时，才具有活性，而这两种蛋白之间的平衡,取决于细胞中抑制蛋白质自身的浓度。由于细胞在生长过程中体积不断增大，蛋白浓度下降,形成单体形式，失去抑制作用，质粒拷贝数增加。但由于拷贝数增加抑制蛋白编码基因数目也随之增加到一定程度又导致质粒复制受抑制。②自体阻遏蛋白质模型质粒的复制是由起始蛋白Rep引发的,该蛋白是复制启动作用的限速因子.它的浓度决定着每个细胞每个世代的质粒的最终复制总数.Rep蛋白编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子,共转录成同一个mRNA分子.自体阻遏蛋白同启动子-操纵子区(P/O)的结合作用,调节质粒的转录,以维持细胞中Atr和Rep蛋白处于恒定的水平.,而由Atr蛋白调节产生的Rep蛋白,则是通过同复制起点(ori)的结合来引发质粒复制.另一种解释是Rep蛋白具有双重功能,既具有自体阻遏蛋白的功能,也可同(P/O)的结合抑制转录,又具有起始蛋白功能,引发质粒复制.4三、质粒DNA的分离与纯化1．氯化铯密度梯度离心法原理：由于质粒DNA与染色体DNA在化学结构上并没有什么差别，因此，要使质粒DNA与其寄主染色体DNA区分开来，就必须从两者DNA的高级结构上寻找突破口。实验表明，在细胞裂解和DNA的分离过程中，大分子量的细胞染色体DNA容易断裂成相应的线性片段，而质粒DNA由于分子量小，结构紧密，因此仍能保持完整的状态。氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这种寄主染色体DNA与质粒DNA在高级结构上的差别(或说是异质性)而分离纯化的技术。在氯化铯密度梯度离心中，氯化铯是作为介质其密度为1.7g/cm3，经过一段超速离心平衡之后，便形成了1-1.9052g/cm3的连续的浮力密度梯度。已知大肠杆菌寄主染色体DNA、质粒DNA、大肠杆菌寄主染色体DNA和RNA等4种大分子物质，具有不同的浮力密度，因此经过超离心平衡之后，便会分布在CsCl连续密度梯度介质的等密度位置上，从而达到了彼此分离的目的。缺陷：尽管氯化铯-EtBr密度梯度离心法可以得到高纯度高质量的质粒DNA，但是操作复杂，且需要昂贵的氯化铯和超离心设备，并且溴化乙锭又是极强的致癌物质。所以目前最流行的分离纯化质粒DNA地方法是碱变性法。2.碱变性法原理：是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当通过致冷或恢复中性pH值，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能准确复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。四、质粒载体的构建及其类型质粒载体必须具备的条件a.具有复制起点：这是质粒增殖所必不可少的条件，亦可帮助维持正常的质粒拷贝数b.具有抗菌素抗性基因：提供转化子的选择记号，理想的质粒载体应具两个抗菌素抗性基因。在外源DNA插入之后，仍应保留一个强选择记号。c.具有若干种限制酶单一识别位点：这一特点可满足克隆需求，而且要求在插入了外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。d.具有较小的分子量和较高的拷贝数：易于操作，而且在插入了外源DNA(一般不超过15Kb)仍可有效地转化受体细胞。天然质粒用作克隆载体的局限性：（图）51.质粒载体选择记号在基因克隆中采用的质粒载体，大多数都是使用抗菌素抗性记号，一方面是由于许多质粒本身就带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子，另一方面因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。下面是克隆中常用的几种抗菌素：a.氨苄青霉素抗性基因(ampr)b.氯霉素抗性基因(cmlr)c.卡那霉素抗生基因(Kanr)d.链霉素抗性基因(strr)e.四环素抗性基因(tetr)2.不同类型的质粒载体（图）五、重要的大肠杆菌质粒载体1．pSC101质粒载体是一种典型的严紧型控制的低拷贝的大肠杆菌质粒载体，是第一个成功地用于在E.coli中克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体：拷贝数：1-2个/cell分子大小：9.09Kb抗性表型：terr2.pBR322质粒载体（图）①pBR322质粒载体的构建pBR322质粒按照标准的质粒载体命名法则命名的.”P”表示它是一种质粒;而”BR”分别取自6该质粒的两位主要构建者F.BolivarR.L.Rodriguez姓氏的头一个字母.”322”实验编号,和其他质粒载体pBR325、pBR327相区别。它是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基因（ampr）第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）第三部分来源于ColE1派生的质粒pMB1的DNA复制起点（ori）②pBR322质粒载体的优点具有较小的分子量，不仅易于自身纯化，而且克隆外源片段可高达6kb；具有两种抗性基因可供作转化子的选择记号用于筛选；有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。为重组体DNA的制备提供了极大的方便。③pBR322质粒载体的缺点：a.pBR322质粒载体虽然失去了迁移蛋白质基因mob，但却保留着这种蛋白质的作用位点bom。因此在F、ColK和pBR322三种质粒共存的情况下，由ColK质粒产生的迁移蛋白质就会作用于pBR322的bom位点，通过F质粒提供的转移装置而发生迁移作用。现在已构建了若干种缺失了bom位点的派生质粒。b.pBR322质粒上的EcoRI位点不会发生插入失活，而EcoRI酶又是基因工程中最常用的一种核酸内切限制酶。3.pUC质粒载体pUC是因为它是由美国加利福尼亚大学的科学家J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建。由四个部分组成：1.来自pBR322质粒的DNA复制起点（ori）2.氨苄青霉素抗性基因（am