第九章发育毒性与致畸作用

第九章发育毒性与致畸作用掌握致畸试验的试验设计、程序、评价。熟悉致畸作用的毒理学特点；致畸物的评价与分级；发育毒性体外试验。了解致畸作用的机制。重点：致畸试验的试验设计、程序、评价。难点：致畸试验的试验设计。教学提纲：1.概述：（1）发育毒理学。（2）从畸胎学到发育毒理学。2．发育毒性与致畸性：（1）基本概念和发育毒性的终点。（2）发育各阶段发育毒性作用的特点。（3）母体毒性与发育毒性。（4）发育毒性的剂量-反应模式和阈值的概念3．致畸（发育毒性）作用机制。4．发育毒性和致畸作用试验与评价:（1）动物发育毒性试验。（2）流行病学研究和人类的证据（3）发育毒性的替代试验。概述发育毒理学（developmentaltoxicology）主要研究外源化学物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验，其中主要为致畸试验。从畸胎学到发育毒理学外源化学物或其他环境因素与机体接触后，可以干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。另外，哺乳动物的性激素对生殖发育过程也具有调节作用，正常的生殖发育必须在激素调节作用下完成。所以外源化学物，一方面直接作用于生殖发育过程，同时又可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。例如，男性的睾丸萎缩和各种形式的性机能减退，女性可出现痛经、月经紊乱，甚至闭经。卵细胞的受精过程也可受到某些外源化学物的干扰，出现不孕症。此外，神经系统对内分泌功能也有调节作用，因而也可间接影响性腺功能以及生殖发育过程，即通过下丘脑-垂体-睾丸轴或下丘脑-垂体-卵巢轴两条途径作用于生殖发育过程。有些外源化学物与机体接触后，还可以引起各种类型的形态和结构的异常。例如，正在发育中的精细胞可以出现形态畸形或数目变化，而畸形的精子往往也具有功能缺陷。卵细胞受到外源化学物的损害作用后，可以出现死亡或影响其正常受精过程，有时即使能受精，也可能出现胚胎死亡，有些胚胎即使能存活，其正常发育也受到干扰，以致胎仔（儿）出现外观或功能异常。外观的异常通常称为畸形（malformation）。它是外源化学物干扰正常生育繁殖过程的一种表现，称为致畸作用（teratogenic）。发育毒理学是在畸胎学基础上发展起来的毒理学分支学科。但是，畸胎学，或出生结构缺陷的研究，作为一个描述性的科学在有文字之前就已经存在了。四大文明古国都有畸胎的记载，最早可以追溯到6500D.B.。那时人们相信异常的婴儿是上天的惩罚、星象的反映和未来的预兆，或者是人和动物之间杂交的结果。随着16、17世纪生物科学的兴旺发展，willianharvy于1651年提出了畸形起因于器官或结构的不完全发育的发育障碍学说，来解释除遗传起源以外的历有畸形。现代实验畸胎学开始于19世纪初，许多19和20世纪的胚胎学家，使用各种不同的物理(震动，倒置，针刺)和化学因素处理鸡蛋，产生了畸形小鸡，重要的是，他们注意到作用时间在决定畸形类型方面比损伤的性质更重要。反应停(thalidomide)，20世纪60年代前后在欧洲和日本广泛作为安全有效的抗早孕反应药物，口服剂量50—200mg／d。1961~1962年，联邦德国的儿科病房中出现了大量罕见的短肢畸形儿，多数为四肢缺陷、无眼、腭裂、骨骼发育不全、十二指肠和肛门闭锁。同一时期，全球出现了5850个短胶畸形儿。McBride和Lenz在德国和澳洲的独立研究，均确认反应停是其原因。反血停被迫从市场撤回，动物模型复制成功。其致畸剂量相当于1mg／(kg.d)，只要末次月经后6~8周内口服200mg反应停便可引起严重的短肢畸形；服药妇女还有流产、早产和死胎等发生。反应停事件是人类历史上的一个悲剧。但由此，促进了化学致畸的研究以及管理法规的建立。在许多国家中，管理机构开始发展动物测试方法并与慢性毒性研究分开，以评估药物对妊娠的影响。1966年美国FDA提出了三段生殖毒性试验指南，包括对致畸等发育毒性的评价。但是，尽管早就提出了发育毒性的四大表现，实际研究中仍将注意力放在致畸作用上，而忽略了对其他发育毒性的评价。直到20世纪80年代后期美国环境保护局(EPA)提出可疑发育毒物危险度评价指南，第一次明确提出了对发育毒性的评价。我国每年有30—40万患严重的、肉眼可识别的先天缺陷的新生儿出生，其中很大比例在一年内死亡。先天畸形占围生期死亡原因的第二、第三位。先天缺陷导致寿命缩短是肿瘤和心血管疾病的8倍和5倍发育毒性与致畸性发育毒理学(developmentaltoxicology)是毒理学的重要分支学科，研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的发育过程中，由于出生前接触导致异常发育的理化因素或环境条件后的发病机制和结果。一、基本概念发育毒性(developmentaltoxicity)指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前内出现的有害作用，包括：结构畸形、生长迟缓、功能障碍及死亡。能造成发育毒性的物质称为发育毒物(developmentaltoxicant)。发育毒物应是在未诱发母体毒性的剂量下产生发育毒性的物质。某些外源化学物可干扰胚胎以及胎儿的发育过程，影响正常发育。具体表现可分为：1、生长迟缓：即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。2、致畸作用(teratogeniceffect)：由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现。3、功能不全或异常：即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。功能不全或异常往往在出生后一定时间才被发现，因为正常情况下，有些功能在出生后一定时间才发育完全。4、胚胎或胎仔致死作用：某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。具体表现为天然流产或死产、死胎率增加。在一般情况下，引起胚胎或胎仔死亡的剂量较致畸作用的剂量为高，而造成发育迟缓的剂量往往低于胚胎毒性作用剂量，但高于致畸作用的剂量。以上四种发育毒性的具体表现并非一定在一种外源化学物作用下同时出现，有时只出现其中的一种或一部分。此外，有些外源化学物通过胎盘与发育中的胚胎或胎仔接触，还可以引起子代肿瘤发生率增高。致畸作用是外源化学物发育毒性的一种具体表现，对存活后代机体影响较为严重，往往是一种不可逆过程，具有重要的毒理学意义，本节也将以致畸作用为重点，进行讨论。畸形(malformation)：器官形态的异常。变异(variation)：集体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即为变异。畸胎(terate)：具有畸形的胚胎或胎仔。致畸物或致畸原(teratogen)：凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。致畸试验：评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。畸形时胚胎或胎儿的某些细胞在生长发育的最敏感阶段受损的结果。致畸作用是外源化学物毒性作用的一种表现。先天性畸形并非一定具有遗传性，而且大多数先天畸形并不具有遗传性，但也确有一部分先天性畸形具有遗传性，可传给后代。凡由于外源化学物损伤生殖细胞所引起的先天性缺陷或异常，具有遗传性，可有亲代动物遗传给子代。如果此种损害仅涉及体细胞，与生殖无关，则所引起的先天畸形不具有遗传性。根据目前致畸试验的概念和方法，涉及范围仅限于体细胞受损所引起的畸形，即外源化学物干扰胚胎器官形成过程的结果。除外源化学物具有致畸作用外，其他物理因素（如放射线）和生物因素（如风疹病毒）也可引起胎儿畸形。目前在毒理学中，主要以化学物的致畸作用作为研究对象。胚胎毒性作用(embryotoxicity)外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。二、发育各阶段发育毒性作用特点器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感具有发育毒性的外来化合物与发育中的胚胎或胎仔接触，可因胚胎或胎仔所处的发育阶段不同而呈现不同的敏感性。有性生殖动物由受精卵发育成为成熟个体的过程，可概括为胚泡形成、着床、器官发生、胎儿发育以及新生儿发育等阶段。着床前的胚胎对胚胎致死作用较为易感，对致畸作用并不如此。在胚胎发育后期和新生儿期，最容易表现的发育毒性是生长迟缓和神经、内分泌以及免疫系统机能的改变。胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽较胚胎为低，但仍有一定数目的死产胎发生。在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段是器官发生期，一般称为危险期或关键期。在常用试验动物中，自受精日计算，大鼠器官发生期约为9～17天，小鼠器官发生期为7.5～16天，家兔为11～20天。在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态结构异常，但如在着床前胚泡形成阶段接触致畸物，则往往出现胚胎死亡，畸形极少。大鼠着床前胚泡形成期，自受精日计算，约为3～4天，开始着床日约为5.5～6天；小鼠分别为3～4天和4.5～5天；家兔分别为3～4天和7天。同一剂量的一种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。例如，以20mg/kg体重剂量环磷酰胺在受精后第8～12天期间，每日分别给予小鼠，虽然畸形多出现于前肢趾部，但畸形种类，则可因给予的日期不同而分别为多趾，并趾，缺趾和无趾。如将大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出现骨骼畸形；如在第12天给予，则诱发腭裂。同样剂量砷酸钠在小鼠受精第7天和第9天分别给予，前者主要出现脐疝，后者主要为露脑。发育中的胚胎对致畸作用的敏感期虽然主要在器官发生期，但在此期间，各种不同器官还各有特别敏感的时间。大鼠器官发生期为受精后9～17天，但眼的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为9～10天之间，脑约为10天，头与脊椎骨约为11天，腭为12～13天，泌尿生殖器官约为15天。三、母体毒性与发育毒性母体毒性(maternaltoxicity)是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。母体毒性作用可分为轻度和严重母体中毒。轻度母体中毒的表现应限于母体体重下降，正常增长受到抑制。抑制程度，不超过不接触受试物对照组动物的10%。肝重可略有增加，但生殖机能正常；严重母体中毒可出现体重增长大幅度抑制、持久性呕吐、过度安静或活动过度、呼吸困难、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡。母体毒性作用与致畸作用关系外源化学物的母体毒性作用与致畸作用的关系有下列几种：1、具有致畸作用，但无母体毒性出现。表明此种外源化学物的致畸作用具有特定的作用机理，与母体毒性无关。此种受试物致畸作用往往较强，应特别注意。2、出现致畸作用的同时也表现母体毒性。此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体具有损害作用，但二者并无直接联系。3、不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态，以致对胚胎具有非特异性的影响，并造成畸形。4、仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。5、在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。此种情况较为复杂，实际有两种可能:一种是受试物确实不具有致畸作用，而且也不具有母体毒性；另一种情况是动物接触的剂量未达到致畸作用的最小有作用剂量，即致畸阈剂量，并非真正不具有致畸作用。在对一种外源化学物进行致畸试验时，如未观察到致畸作用，也无母体毒性表现，应在动物可能耐受条件下，最大限度地增加剂量，使其远远高于人类实际可能接触的水平，如仍未出现致畸作用，才可做出结论。严格的概念，在一定剂量下，能引起母体毒性作用，但未观察到致畸作用，才可以认为不具有致畸作用。母体毒性致畸作用较母体毒性作用剂量为低。四、发育毒性的剂量-反应模式和阈值的概念1、剂量效应关系复杂的表现及原因是：（1）机体在器官形成期间，与具有发育毒性的化合物接触，可以出现畸形，但也可引起胚胎致死。当剂量增加时，毒性作用增强，但二者增强程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增强更较明显，而致畸作用并不如此。由于胚胎死亡增加，畸胎数将因而减少。（2）某种致畸物可以引起一定的畸形，但在同一条件下