第五章色谱法-1

39第五章色谱法重点:基本原理、分类、特点及应用范围，仪器基本构造、色谱条件选择及定性定量分析难点:基本原理、色谱条件选择及定性定量分析§1概述一.色谱法的实质色谱法：利用混合物中各组份在互不相溶的两相(固定相和流动相)中的吸附能力、分配系数或其他作用性能的差异,进行分离和测定的一类分析方法。色谱法实质上是一种分离与检测结合的技术。1906年由俄国植物学家茨维特(Tsweet)分离植物色素时创立。见图。固定相:固定不动的一相;流动相：携带样品流经固定相的流动体。当流动相中的样品混合物经过固定相时,会与固定相发生作用,由于各组分性质、结构上存在差异,与固定相的作用强弱差异大,不同组分在固定相中的滞留时间有长有短,从而按先后次序从固定相中流出，即彼此分离，形成色谱图。二．分类1.按两相状态分流动相为气体者称气相色谱(GC)。其中固定相是固体吸附剂时称气固色谱(GSC);固定相是固定液(附着在惰性载体上的一薄层有机物液体)的称为气液色谱(GLC)。流动相为液体者称液相色谱。分液液色谱、液固色谱。如高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱、离子色谱(IC)、毛细管电泳(CE)等。流动相为超临界流体的色谱称为超临界流体色谱(SFC)。2.按分离机理分吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等。吸附色谱:利用组分在吸附剂上的吸附能力强弱不同达到分离目的;分配色谱:利用组分在固定液(固定相)中的溶解度不同达到分离目的;离子交换色谱:利用组分在离子交换剂上的亲和力大小不同达到分离目的;凝胶色谱：利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离目的;亲和色谱:利用不同组分与固定相(固定化分子)的高专属性亲和力进行分离的色谱法,常用于蛋白质的分离。3.按固定相外形分柱色谱:固定相装于柱内的色谱法;平板色谱:固定相呈平板状的色谱法,可分为薄层色谱和纸色谱。三.色谱图及有关术语1.色谱图组分在检测器上产生的电信号（强度）对时间作图，所得曲线称为色谱图。又称色谱流出曲线。曲40线上突出的部分就是色谱峰。见图正常的色谱峰是对称的高斯(Gauss)正态分布图。2.基线实验条件下,色谱柱后没有组分流出、只有流动相进入检测器时的信号--时间曲线称为基线。稳定的基线是一条水平直线。若为斜线，称为基线漂移；若基线上下波动，就称为噪声。3.保留值表示各组分在色谱柱中滞留时间的数值，通常用时间或将组分带出色谱柱所消耗流动相的体积来表示。条件一定时，每一种物质都有一个确定的保留值，故保留值可作为定性的依据。（1）时间tＭ（t0）:不与固定相发生作用（吸附或溶解）的物质从进样到出现色谱峰峰值所需的时间。其运动速度与流动相的平均线速度u相同，u与柱长L及tＭ的关系：u=L/tＭ(5-2)(2)保留时间tR：组分从进样到出现其色谱峰值所需的时间。(3)调整保留时间tRˊ：扣除死时间后组分的保留时间。是组分在固定相中实际滞留的时间。tRˊ=tR-tＭ(5-3)由于组分在色谱柱中的保留时间tR，包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中实际滞留的时间,tR实际上是组分在固定相中停留的总时间。色谱保留值也可用保留体积来表。(4)死体积VM指不与固定相发生作用的物质从进样到其色谱峰峰值出现所消耗的流动相的体积。即色谱柱内所有空隙的总体积。VＭ=tＭ·FC0(5-4)式中,FC0—经校正后的流动相体积流速，(mL.min-1)。(5)保留体积VR组分从进样到其色谱峰峰值出现所消耗的流动相的体积。VR=tR•Fc0(5-6)(6)调整保留体积VRˊ某组分扣除死体积后的保留体积。VRˊ=VR-VＭ=tRˊ•FC0(5-7)(7)相对保留值r2,1某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比,，又称选择因子。r2,1=tR2ˊ/tR1ˊ=VR2ˊ/VR1ˊ(5-8)在定性分析中,通常固定一个色谱峰作为标准(s),然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值：r2,1=tRˊ(i)/tRˊ(s)(5-9)规定：tR(i)ˊ为后出峰的调整保留时间，所以r2,1总是大于1。由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关,所以在色谱法特别是气相色谱法中广泛用作定性依据.4.色谱峰宽、峰高和峰面积41色谱峰宽有三种方法表示：(1)标准偏差σ:即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。见图(2)半峰宽Y1/2（或W1/2）:峰高一半处对应的峰宽。Y1/2=2.355σ(5-10)(3)峰底宽Y（或W）:从色谱峰两侧拐点所作的两条切线在基线上的截距。Y=4σ(5-11)(4)峰高h:色谱峰最高点与基线之间的距离.可用mm、mv或mA表示.(5)峰面积A:由色谱峰与峰底之间所围成的面积.5.从色谱图（流出曲线）得到的信息(1).根据色谱峰的个数可以判断样品中所含组分的最少个数;(2).根据色谱峰的保留值,可以进行定性分析;(3).根据色谱峰的面积或峰高,可以进行定量分析;(4).色谱峰的保留值及其色谱峰宽是评价色谱柱分离效能的依据;(5).两峰间的距离是评价固定相(或流动相)选择是否合适的依据.§2色谱法基本原理组分要达到完全分离,两峰间的距离应足够远,两峰间的距离是由组分的分配系数决定的,即与色谱过程的热力学性质有关;但两峰间虽有了一定的距离,如果每个峰都很宽,彼此重叠,还是不能分开。各组分色谱峰的宽与窄是由其在色谱柱中的传质和扩散行为所决定的,即与色谱过程的动力学性质有关。因此,要从热力学和动力学两方面来研究色谱分离。一.分配系数K和分配比k1.分配系数K分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间多次反复的分配过程,这种分离过程常用组分分子在两相间分配系数来描述.在一定温度和压力下,组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的浓度的比值称为分配系数:K=Ｃs/Ｃm(5-12)Ｃs－组分在固定相中的浓度；Ｃm－组分在流动相中的浓度分配系数仅与固定相和温度有关。K越小的组分越先流出色谱柱，出峰。只有当两组分的K不同时，才能彼此分开。2.分配比k′分配比又称为容量因子，指在一定的温度和压力下,组分在两相间分配达到平衡时,在固定相和流动相中的质量比:k′=ms/mm(5-13)42ms－组分在固定相中的浓度；mm－组分在流动相中的浓度k′值越大,组分在固定相中的量越多,相当于柱的容量越大,因此k′又称为容量因子。容量因子是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k由组分和固定相的热力学性质决定,不仅随柱温、柱压变化而变化,而且还与流动相和固定相的体积有关。k′=ms/mm=ＣsVs/ＣmVＭ(5-14)Vm--柱中流动相的体积,近似等于死体积;Vs--柱中固定相的体积。分配比k′可直接从色谱图中测得：（推导略）k′=(tＲ–tＭ)/tＭ=tＲ′/tＭ=VＲ′/VＭ(5-19)3.K与k′的关系K=Ｃs/Ｃm=ms/Vs÷mm/Vm=k′·Vm/Vs=k′·β(5-20)式中,β—相比，即两体积比。4.K、k′与选择因子α的关系对A、B两组分的选择因子：γ=tＲˊB/tＲˊA=k′B/k′A=KB/KA(5-21)若γ=1,两组分的色谱峰重合分不开；两组分的K或k′值相差越大,则分离越好。两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。二.塔板理论1.塔板理论塔板理论是由马丁(Martin)和辛格(Synge)首先提出的半经验理论。将色谱柱看作一个精馏塔,沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为,同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。该理论假定:(1).在柱内一小段长度H内,组分可以在两相间迅速达到平衡.这一小段柱长称为理论塔板高度H;(2).气相色谱的流动相(载气)进入色谱柱是脉冲式的,每次进入柱中的体积为一个塔板体积;(3).所有组分开始时存在于第0号塔板上,且组分的纵向(沿色谱柱方向)扩散可忽略不计;(4).分配系数在所有塔板上都为常数,而与组分在塔板上的量无关。见图假设:色谱柱的长度为L,柱中各段的塔板高度H都是相同的,则柱子的总的塔板数n为:n=L/H或H=L/n(5-22)由塔板理论的流出曲线方程可导出：n=5.54(tＲ/Ｙ1/2)2=16(tＲ/Ｙ)2(5-26)可见:色谱峰越窄,塔板数n越多,理论塔板高度H越小,柱效越率高。通常,填充色谱柱的n在103以上,H在1mm左右;毛细管柱n=105－106,H在0.5mm左右。上式保留时间中包括死时间,而在死时间内不参与柱内的分配,所以计算出来的柱效与实际柱效相差很远。因此，一般将扣除死时间后的有效理论塔板数neff和有效塔板高度Heff作为柱效能指标，更准确。43neff=5.54(tＲ′/Ｙ1/2)2=16(tＲ′/Ｙ)2(5-27)Heff=L/neff(5-28)注意:在相同色谱条件下,对不同的物质计算所得的塔板数不一样,因此,在说明柱效时,还应指出是对什么物质而言。2.塔板理论优缺点(1).用热力学观点形象地描述了组分在色谱柱中的分配平衡和分离过程,导出了流出曲线的数学模型,并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置,还提出了计算和评价柱效的参数。(2).由于塔板理论是建立在一系列假设的基础上的,它的假设不完全符合色谱分离过程,它忽略了纵向扩散,也没有考虑各种动力学因素对色谱柱内传质过程的影响。因此不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素,也不能说明为什么在不同流速下测得的理论塔板数不同。三.速率理论1956年,荷兰学者范第姆特(vanDeemter)在塔板理论的基础上,将动力学因素结合进去,即将色谱分配过程与分子扩散和在流动相及固定相中的传质过程联系起来,建立了速率理论，该理论模型对气相和液相都适用。范第姆特方程（范氏方程）的简化式为:H=A+B/u+Cu(5-29)式中:u—流动相的线速度;A、B、C—常数,分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。当u一定时,只有A、B、C较小时,H才能较小,柱效率（n）才能高。1.涡流扩散项(1)涡流扩散的产生在填充色谱柱中,当组分随流动相向柱出口迁移时,流动相由于受到固定相颗粒障碍,不断改变流动方向,使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动,故称为涡流扩散。见图(2)涡流扩散对峰宽的影响由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性,使组分在色谱柱中的路径长短不一,因而同时进色谱柱的相同组分达到柱出口的时间不一致,引起了色谱峰的变宽。变宽的程度由下式决定:A=2λdp(5-30)式中:dp--填充物的平均直径;λ—填充不规则因子;(3)减少涡流扩散的方法使用细而均匀的固定相颗粒，且填充均匀。2.分子扩散项B/u(纵向扩散项)(1)分子扩散项的产生分子扩散项是由浓度梯度造成的。组分从柱子入口加入时,其浓度分布的构型呈“塞子”状.在“塞子”的前后存在着浓度差别而形成浓度梯度,随着流动相的向前推进,“塞子”必然自发地向前和向后扩散,造成谱带展宽。(2)分子扩散对峰宽的影响44分子扩散项系数为:B=2γDg(5-31)式中:γ—弯曲因子(填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素),它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况;Dg--组分在流动相中的扩散系数,cm2.s-1。(3)影响分子扩散项系数的因素分子扩散项系数与Dg和弯曲因子成正比.①Dg与组分性质、柱温、柱压和流动相性质有关.气相的扩散系数比液相约大105倍，在液相色谱中可以忽略其引起的峰扩展。Dg与组分的分子质量、流动相的分子质量的平方根及柱压成反比;Dg与柱温成正比。②与组分在柱中的停留时间有关。所以,流动相流速越小,扩散越大。(4)降低分子扩散项的方法使用分子质量大的气体（Ａr气）作流动相、用较高的流速、降低柱温。3.传质阻力项Cu传质阻力系数C由流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs组成：C=Cm+Cs(1)气相色谱Ａ.气相(流动相)传质阻力系数Cm气相传质过程是指试样组分气相移动到固定相表面的过程.在这一过程中,试样组分将在两相间进行质量交换,即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走，有的则进入两相界面又来不及