第4章细菌的生化试验

第四章细菌的生化试验微生物生化反应：指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。微生物检验中常用的生化反应有：糖或醇类发酵试验淀粉水解试验V-P试验甲基红（MR）试验靛基质（Indole）试验过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验明胶液化试验尿素酶（Urease）试验氧化酶试验硫化氢（H2S）试验三糖铁（TSI）琼脂试验氨基酸脱羧酶的测定耐盐性试验卵磷脂酶的测定石蕊牛奶反应酪蛋白水解苯丙氨酸脱氨试验氰化钾试验对叠氮化钠的抗性硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验含碳化合物的利用（柠檬酸盐或丙酸盐利用）第一节细菌的生化试验一、概述（一）、什么是生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。（二）检验细菌的生化试验范围1、糖（醇）类代谢试验2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验4、呼吸酶类试验5、毒性酶类试验（三）生化试验的方法在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。（四）生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。2、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇），有的只能分解1~2种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2、试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃培养1~3天，每天观察结果。3、结果观察和记录记录：产酸不产气，阳性，以“+”表示产酸产气，阳性，以“⊕”表示不产酸产气，阴性，以“-”表示（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验1、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。2、方法取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4h天，每天观察结果。3、结果观察与记录（三）V-P试验1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。2、试验方法（１）奥梅拉法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃培养48h，每1ml培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml，摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h，或在48~50℃水浴放置2h后判定结果。（2）贝立脱法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃培养2天，每2ml培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1℃培养4h，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。（3）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。3、结果观察与记录（1）发酵管出现红色者，为阳性，记V-P+（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记V-P-（四）甲基红试验（MR）1、原理细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。2、试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃或30℃（以30℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。MR-VP试验原理及照片3、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR+；（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。（五）七叶苷水解试验１、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。2、试验方法：将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于36±1℃培养24h,观察结果。3、结果观察与记录（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为+（2）培养基不变色者，为阴性，记录为-（六）甘油品红试验1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。2、试验方法：取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于36±1℃培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。3、结果观察与记录（1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+；（2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-复习题1、什么是生化试验?2、做生化试验要注意哪些事项？3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录5、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录（一）靛基质（吲哚）试验（二）H2S试验（三）尿素酶试验（四）氨基酸脱羧酶试验（五）苯丙氨酸脱氨酶试验(六)明胶（Gelatin）液化试验（一）靛基质试验1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。2、试验方法：所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂;（2）欧—波试剂将待检菌小量接种于培养基中，于36±1℃培养24~48h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。靛基质试验原理及照片3、结果观察与记录呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+无红色者，为阴性反应，记-（二）硫化氢（H2S）试验1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于36±1℃培养24~48h，观察结果。3、结果观察与记录培养基底部呈黑色，为阳性，记+培养基底部无黑色，为阴性，记-（三）尿素酶试验1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。2、试验方法：挑取大量培养18~24h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。尿素酶试验图3、结果观察与记录培养基变呈粉红色，为阳性，记+培养基颜色不变，为阴性，记-（四）氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶,可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用,生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性,如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。2、试验方法取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在36±1℃培养1~4天，每天观察结果。3、结果观察与记录试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记+试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记-。阳性反应试验管颜色变化过程紫色→黄色→紫色原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（10~12h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性，指示剂显紫色。（五）苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。2、试验方法从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在36±1℃培养18~24h后，加入氯化铁溶液4~5滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。3、结果观察与记录试验管立即出现绿色，为阳性，记+无色为阴性，记-。（六）明胶液化试验1、原理有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。2、试验方法挑取培养18~24h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置20~30min后，再观察结果。3、结果观察与记录明胶液化，为阳性，+。明胶凝固，为阴性，-。复习题1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项2、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项3、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果的记录4、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理四、有机酸盐和铵盐的利用试验枸橼酸盐利用试验丙二酸盐利用试验（一）枸橼酸盐利用试验1、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。2、试验方法挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在36±1℃培养1~4天，每天观察结果。3、结果观察与记录斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-枸椽酸盐试验原理及斜面照片（二）丙二酸盐利用试验1.原理:某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。2、试验方法取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于36±1℃培养48h，观察结果。3、结果观察与记录培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+;培养基无颜色变化,为阴性,记-五、呼吸酶类试验氧化酶试验过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验氰化钾试验（一）氧化酶试验1.原理:氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和α-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。试剂1%α-萘酚-乙醇液1%盐酸二甲基对苯二胺2、试验方法用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂1~2滴在培养物上,再加入1%α-萘酚-乙醇液1~2滴,在30秒内判定试验结果。3、结果观察与记录在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记+不变色或为红色者,为阴性,记-（二）过氧化氢酶试验1.原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。2、试验方法挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。3、结果观察与记录产生气泡者