生化大实验报告

生化实验报告[键入文档副标题]实验一多酚氧化酶（PPO）的分离与提取一、实验目的1、本实验以马铃薯为主要的实验材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。2、通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。二、实验原理多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，参与植物抗体的调节，属于末端氧化酶的一种。在植物体受到机械损伤和病毒感染后，PPO催化酚与氧氧化成醌，使组织形成褐变，对PPO弄得的测定便是通过PPO氧化酚产生醌的变色反应测定其酶活性。在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶；而在蛋白质水溶液中继续加入无机盐类可以其溶解度降低而析出的过程，该现象称为盐析。蛋白本身随盐浓度的溶解度变化曲线具有特征性，可以依据此分离蛋白，硫酸铵分级便依据此原理，首先在蛋白质溶解度最高时，离心取上清，去除此时未溶解或已经沉淀的杂蛋白，之后再其溶解度最低且未变性的时候离心取沉淀复溶，去除尚未析出的杂蛋白，从而达到纯化目的蛋白的目的。多酚氧化酶在40%硫酸铵溶液中溶解度最高，而在75%硫酸铵溶液中沉淀量最高，由此可分离提取多酚氧化酶。但使用硫酸铵分级，分离后的产物中会有铵根离子残留，如果采用凯氏定氮法测定蛋白质浓度时，残留的铵根离子会造成测定时高于实际值，同时该样品之后会用于离子交换层析纯化，所以需要去除其中的离子，故需要透析去除其中铵根离子。多酚氧化酶提取在PH6.0的中性偏酸条件下进行，在此PH值下，磷酸缓冲液的缓冲能力最强，故选择使用其作为缓冲液，其中加入的EDTA为螯合剂，聚乙烯比咯烷酮是用于吸附醌，本身为固体颗粒，不需要溶解。三、仪器与试剂：（1）马铃薯200g（2）试剂：溶液A：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯比咯烷酮）固体硫酸铵溶液B：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005M氯化镁）实验器械与仪器设备：烧杯，玻璃棒，量筒，天平，高速冷冻离心机，离心杯，透析袋，植物组织匀浆器，过滤纱布。四、实验步骤：1、将马铃薯切削块，按照1g:1ml的比例加入0.03M磷酸缓冲液，放入植物组织匀浆器，将马铃薯充分粉碎使PPO从细胞中释放出来。2、将处理过的溶液用四层纱布过滤，去除溶液中的大颗粒固性物质，装离心瓶配平后，12000转离心10min。3、离心后取上清液162ml，查表知欲得到0℃硫酸铵40%饱和度需要加入无水硫酸铵29.92g，称量加入溶液中，用玻璃棒轻轻搅拌，避免因为机械剪切导致蛋白变性，0℃静置一小时。4、静置一小时后，装离心瓶，调平后离心机12000转离心10min，弃沉淀得上清液192ml，查表知欲得0℃硫酸铵75%饱和度需要再加无水硫酸铵35.90g，称量后加入，用玻璃棒轻轻搅拌，0℃静置2小时沉淀。5、将透析前样品抽500ul作为粗酶样品。6、两小时后，装离心瓶，调平后12000转离心10min，弃上清液，沉淀加10ml溶液B复溶，装透析袋绑好透析过夜。实验二离子交换柱层析纯化多酚氧化酶（PPO）及活性测定一、实验目的1、本实验拟通过离子交换层析分离纯化PPO的操作，掌握该层析的基本原理、运用及操作技术。2、通过纯化PPO检验之前提取PPO的实验是否成功。3、通过本实验学习并掌握传统的蛋白质活性及浓度测定的方法、原理及相关仪器设备的操作。二、实验原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为3部分；高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为；阳离子交换反应:(R—X-)Y++A+(R—X-)A++Y+阴离子交换反应:(R—X+)Y-+A-(R—X+)A-+Y-R代表离子交换剂的高分子聚合物基质,X-和X+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团,Y+和Y-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子,A+和A-分别代表溶液中的离子基团。当A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子,或者提高A离子的浓度,或者通过改变其他一些条件,可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说,在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。PPO是通过DE52弱碱性阴离子交换剂分离纯化的，过程大体为：阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来,随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大到顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。分离过程中的蛋白质浓度是通过考马斯亮蓝技术测定的，考马斯亮蓝法(Bradford法)是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(λmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，该染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595nm，与蛋白质浓度成正比。PPO催化各种酚与氧气氧化为醌，以邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液pH=8.5的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值发生变化，通过OD值上升的度数变化确定PPO的酶活力大小。三、仪器与试剂：试剂：0.02MTris-HCl缓冲液PH7.4(内含0.001MEDTA)，考马斯亮蓝试剂，柠檬酸缓冲液，邻苯二酚，氯化钠；聚乙二醇；DEAE-纤维素DE52；设备：试管与试管架、烧杯、玻璃棒、滴管等、层析柱，PH试纸，恒流泵，梯度混合仪，核酸蛋白检测仪，GL-20C高速冷冻离心机，酶标板、分光光度计、分析天平、容量瓶、移液管和试管等。四、实验步骤（1）将经过透析的PPO蛋白粗酶溶液放入50ml离心管中12000转4℃离心10min，取上清液备用，以此确保无固性物质，防止其破坏胶体。（2）将层析柱洗净，并确保在下出水口处没有气泡存留且可以正常出水，将已经配置好的柱材轻轻倒入层析柱中，匀速添加防止出现多个柱面，直到柱面到达8cm左右时停止。（3）装好的层析柱上端连接恒流泵，下端用一烧杯承液，恒流泵首先连接缓冲液，利用缓冲液将层析柱中的溶液置换出来，约5分钟后开始用PH试纸检测下出水口流出液体PH值，直到流出液PH与缓冲液PH相同时停止。（4）将粗酶液上柱，用微量移液器缓慢加入，加样过程中连续，保证液面在柱面上1cm处，防止液体低于柱材破碎，共上样10ml。（5）用含氯化钠（0.2-0.6M）的0.02MTris-HCl缓冲液PH7.4（内含0.001MEDTA）进行梯度洗脱。（6）每5ml一个试管收集并进行编号，首先收集4管，编号1-4，为杂蛋白，之后收集16管样品，编号5-20，为可能含有PPO的样品。（7）从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中，加20ul考马斯亮蓝溶液，室温下静置2min，测其OD595值并进行记录，该数据说明其中粗蛋白含量。（8）从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中，加20ul柠檬酸缓冲溶液并加20ul邻苯二酚于30℃环境中静置2min，测其OD410值并进行记录，该数据说明其中多酚氧化酶的含量。（9）对上一实验中的粗酶提取物样品重复第（7）（8）两步，测其粗蛋白含量及比活力。（10）0-100μg/ml标准曲线的绘制：准确吸取0.5ml含20、40、60、80、100μg蛋白标准液，分别放入10ml的试管中，加5.0ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，将溶液混匀，2min后在分光光度计594nm处测定其吸光值，空白以去离子水或蒸馏水代替。吸光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。（11）样品中蛋白浓度的测定：要求待测样品中的蛋白浓度范围为1-1000μg/ml之间，若浓度过高，需要对其进行适当的稀释，再用制作标准曲线的方法对样品进行测定，测定的0.D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白浓度。五、结果及分析考马斯亮蓝OD595试管编号12345678910OD值0.2060.6050.03700000.0240.1440.31试管编号11121314151617181920OD值0.1720.2110.3860.0840.1680.1320.2310.1860.1180.164柠檬酸缓冲液OD410试管编号12345678910OD值0000000000.026试管编号11121314151617181920OD值0.0420.050.0620.0710.0940.1120.2010.1740.0640.03粗酶提取物比活力：OD410=0.192纯化倍数=纯化后比活力/粗酶比活力：0.201/0.192=1.047结果分析：图1-1多酚氧化酶（PPO）离子交换柱纯化结果多酚氧化酶（PPO）通过离子交换柱纯化的结果如图1-1，横坐标为洗脱体积，对应1-20号试管，共总洗脱体积为100ml。纵坐标为OD值，其中蓝色OD595Z折线表示考马斯亮蓝测定时粗蛋白含量的变化，数值高低表示其中粗蛋白含量多少；红色OD410折线为柠檬酸缓冲液测定时多酚氧化酶含量的变化，数值高低表示其中酶比活力的高低。所有OD值除0值外，均在0.1-0.8之间，无异常值，无需稀释后在测定。考马斯亮蓝测定结果中，2号试管即5-10ml的OD595值最高为0.605，为杂蛋白中蛋白含量最高的。而在含有目的蛋白的5-20号试管中，13号试管OD595值最高为0.386，；4-7管OD595最低为0，该OD值说明的是其中的粗蛋白含量，其中共有5个蛋白峰，分别为2号，10号，13号，15号，17号管，其中2号管为杂蛋白峰。杂蛋白洗脱为1-4号试管，通过折线图可观察到，在4号管处，OD595值为0，并在之后5-7管仍然为0，可认为大部分杂蛋白榆次已经几乎洗脱，柠檬酸缓冲液结果也证明了这一观点。柠檬酸缓冲液中OD410测定过程中，从10号试管开始出现不为0，此时为多酚氧化酶开始洗脱的体积，为45-50ml，其浓度一直处于增加状态，直至17号试管处，此处有峰值为0.201,之后酶活性下降明显，与20号试管处其值仅为0.3，可认为PPO以全部洗脱，故PPO洗脱体积共50ml。纯化倍数为1.047，相较于纯化之前，纯化效果不明显，这与预期的纯化结果相差较多。出现纯化效果不好的原因较多，主要原因可能存在于三个方面：①在多酚氧化酶提取过程中存在问题。可能搅拌时措施不当导致了蛋