生化实验报告1

生物化学实验报告姓名：许梨梨学号：3120100024专业年级：2013级医学影像学组别：第3实验室南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称氨基酸的薄层层析实验日期2014-10-24实验地点第3实验室合作者许琮指导老师何肖娟评分教师签名批改日期一、实验目的1.掌握薄层层析法的一般原理。2.掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。3.掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。二、实验原理（一）薄层层析法薄层层析法是色谱分析技术的一种，一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液体（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而能够将样品各组分分离开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来。吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基，这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。本实验采用硅胶吸附薄层层析。硅胶吸附薄层层析的特点：1.硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。2.硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。3.硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。（二）氨基酸与茚三酮的显色反应茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基酸，与此同时。还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。（三）相对迁移率—Rf值的计算混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rateofflow）来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。三、材料与方法：（一）实验材料1.分析样品：（1）混合氨基酸溶液（2）氨基酸的异丙醇溶液：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。2．试剂：（1）吸附剂：硅胶；（2）黏合剂：0.5%的羧甲基纤维素钠；（3）展层-显色剂：为正丁醇、乙醇、茚三酮、丙酮、蒸馏水混合液；3.仪器及器材：（1）层析板（5*15cm）；（2）小烧杯及药匙；（3）量筒（10ml）；（4）小尺子和铅笔；（5）毛细玻璃管；（6）层析缸；（7）烘箱；（8）天平（二）实验方法1.实验流程：2.操作步骤：四、结果与讨论：（一）结果1.实验现象①调浆：称取硅胶3.5克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8mL，调成均匀的糊状；②涂布：取干净的干燥玻璃板均匀涂层；③干燥：将玻璃板水平放置。室温下放置30分钟以上，自然晾干；④活化：70℃烘干30min。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。①标记：用铅笔在距底边2cm处画上条水平线，在线上均匀确定4个点并做好标记，每个样品间相距1cm。②点样：用毛细管分别吸取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高2cm。轻轻接触薄层表面点样。加样原点扩散直径不超过2mm。点样后自然晾干，必要时重复加样。将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖（层析缸盖上涂上凡士林防止层析液挥发），上行展层。当展层剂前沿到达薄层板中间部分时，即可停止展层，取出薄板，用铅笔描出前沿界限。将薄板置于烘箱中，在70℃烘干30分钟，即可显出各层斑点。调浆制板涂布干燥活化标记点样点样层析显色制板点样层析显色（1）层析时，能清楚地看到展层-显色剂在层析板上运动的痕迹。通过计时及观察展层剂前沿的位置，可以大致看出展层剂前沿的移动速率随前沿所处高度的增加而减缓。当前缘到达层析板中间部位时，能观察到展层剂前沿移动的速率变得非常缓慢。（2）层析过程中层析板上没有显色现象。打开层析缸能闻见浓烈的丙酮味。（3）在烘箱内烘烤10分钟左右时，即可见层析板上开始显现紫红色的斑点，并且斑点颜色在一定时间范围内随时间的增加而加深。丙氨酸的斑点最高，颜色深浅介于甘氨酸和精氨酸之间；甘氨酸斑点位置次之，颜色最浅；精氨酸斑点最低，颜色最深；混合氨基酸处有3个界限较分明的斑点，分别标记为混合点1、2、3。混合点1和丙氨酸位置大致等高，混合点2和甘氨酸的位置大致等高，混合点3和精氨酸的位置大致等高。结果如图1所示。(4)制板时，在自然晾干情况下，原本糊状的固定相逐渐变成固体。图1氨基酸薄层层析结果2.实验数据表1各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离及溶剂前缘至样品中心距离记录单位：cm测定次数各氨基酸色斑中心至原点中心的距离（cm）（a）丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点3123平均a值溶剂前沿距原点中心的距离（cm）（b）2.592.572.602.594.952.012.052.022.034.951.311.301.291.304.952.492.412.422.444.952.001.992.002.004.951.291.291.301.294.953.结果计算与分析根据公式Rf=原点到溶剂前沿的距离距离原点到层析斑点中心的计算各斑点的Rf值，结果记录见表2。表2氨基酸薄层层析的结果记录表各斑点Rf值氨基酸名称丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点30.5230.4100.2630.4930.4040.261---丙氨酸甘氨酸精氨酸层析板上显现出紫红色的较清晰的斑点，并且混合氨基酸处分离出3个界限较分明的斑点。观察各斑点的位置，可见混合点1和的丙氨酸位置大致等高，混合点2和甘氨酸的位置大致等高，混合点3和精氨酸的位置大致等高。可知混合氨基酸被成功分离，并可初步判断混合点1、2、3依次为丙氨酸、甘氨酸、精氨酸。通过比较表2的数据，可以进一步确定混合点1、2、3分别为丙氨酸、甘氨酸、精氨酸。综上所述，本次实验得出混合氨基酸溶液中含有丙氨酸、甘氨酸、精氨酸。实验成功。（二）讨论1.调浆时应充分搅拌，使混合物呈均匀的糊状，若没有搅拌充分使混合物中含有粉块状物质，则会影响层析板吸附力。搅拌动作应较缓慢，过快硅胶粉会被气流吹出来，当硅胶粉丢失过多时会使混合物过稀，一方面会因水分过多，另一方面会使得层析板变薄，两者都会导致其吸附力下降。2.涂布时应选择平整洁净无油污的玻璃板，减少干扰因素，并让整个玻璃板都均匀地涂满硅胶浆，包括角落，一方面能扩大展层板的有效面积，并能使整个层析板有一个均匀的吸附力。可通过轻轻敲打玻璃板使糊状物在玻璃板上分布更为均匀。最后要放置在水平面上晾干。3.点样时应让每个点保持一定间隔，防止层析时发生交叉或拖尾，不能得到很好的分离。使用毛细管时可让毛细管轻轻地在标记点上停留1s左右，观察加样点，当其直径扩大至将近2mm时停止加样，这样可以避免因接触时间过短而增加加样次数。不宜将毛细管头抵在薄板上，这样管内液体很难流下，轻轻接触薄板即可。使加样原点扩散直径不超过2mm，是为防止层析时发生交叉或拖尾。为控制变量，每个点加样时都要使用完毛细管内的液体，必要时重复加样，重复加样要等上一滴晾干时才能继续加下一滴，这样才能防止直径扩张。4.用铅笔做标记时力动作太大会损坏层析板，动作太小标记会不明显，应控制力道。划破展层板会改变展层板在该点附近的吸附力，使氨基酸迁移受阻。并且点样时保证让样点的圆心在画好的标准线上，便于距离的测量。5.展层时层析板摆放位置可适当降低，减小和水平面的夹角，能使展开剂移动地更远，能使混合氨基酸更好地分离。但展层-显色剂的液面必须低于点样线，否则会使样点溶于溶剂中，导致无法展层或参与展层的氨基酸过少。6.烘干前都要注意不要用手接触展层板，因为手上会有汗液，而汗液中又含有较多蛋白质，若在烘干前接触层析板可能会使杂质蛋白质和茚三酮反应，最后在烘干时显色，干扰氨基酸的薄层层析的结果。7.层析时间超过30min，虽然这时候展开剂前沿离层析板的中线仍有一小段距离，但此时展开剂移动已经相当缓慢，可以停止层析。并且取出层析板时应及时标记下展开剂前沿的位置。8.显色所用烘干温度以70℃为宜，过高易造成层析板硅胶裂开。烘干时间大致为15分钟，这时各斑点显色都已比较明显，及时取出能节省实验时间。9.计算Rf值时，发现混合点1、2、3的数值和标准氨基酸溶液的数值存在一定偏差，并且全部是偏小的，一方面可能因为读数存在偶然性，另一方面可能因为此处层析板稍薄，导致吸附力偏低。五、复习思考题1.硅胶的吸附力与含水量的问题硅胶的吸附力与含水量呈负相关，含水量越多，硅胶吸附力越低。因为硅胶是通过其表面的极性硅醇基和许多化合物形成氢键而产生吸附的，水为极性小分子，会和硅醇基形成氢键，使得空余的硅醇基减少，因而对其他化合物而言，硅胶的可结合位点就相应减少，表现出来吸附力降低。2.吸附实验中吸附剂的选择根据吸附剂的选择首先要考虑到待分离物质的特性，要针对性地选择高效的吸附剂。如待分离物质为碱性时，则不宜选用硅胶，因为硅醇基显较弱的酸性。同时要考虑到经济、操作及安全问题，要选择价格便宜，使用简单方便并且对人体对环境等没有伤害的吸附剂。3.氨基酸纸层析，两者有何区别薄层层析以玻璃作为载体，玻璃质地坚硬，能让固定相平整地铺在上面，这样使得展层更为方便，而纸层析因为是以纸为载体，纸张易变形，所以要采用圆形滤纸并通过灯芯的抽吸作用让展层剂均匀地在纸张上流动，操作较繁琐，同时纸层析更易产生误差。薄层层析选用固体的硅胶为固定相，纸层析选用液体水为固定相，二者操作方法不同，前者要先将固定相涂布在玻璃板上制成层析板，而后者将固定相和流动相混合，同时在展层时使用，省去了制作层析板消耗的大量时间。这使得纸层析操作可重复性高。薄层层析是可以将层析产物通过一定手段提取出来的，而纸层析不能。