生化21常用分子生物学技术的原理及应用

第二十一章常用分子生物学技术原理及其应用第1节分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)把不同来源而具有一定同源性的DNA分子放在同一溶液中做变性处理，或把单链DNA与RNA放在一起，在一定条件下，它们之间的同源区域可按碱基互补原则复性形成杂合双链(heteroduplex)，这一过程称为杂交。在杂交之前，通常用琼脂糖凝胶分离待测的DNA分子，再将分离的DNA片段转移到特定的支持物上。由于转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一样，故称为印迹（blotting）。印迹（blotting）（一）Southern印迹杂交Southern印迹杂交（Southernblotting）是指DNA与DNA分子之间的杂交。其基本过程是将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性后，将凝胶中的DNA分子转移到一定的固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。探针（probe）是指经过特殊标记的已知序列核苷酸片段，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA片段。探针的种类寡核苷酸基因组DNAcDNA片段RNA片段标记物放射性同位素生物素荧光染料Southern印迹杂交的基本步骤待测DNA样品的限制性内切酶消化酶切DNA样品的电泳分离凝胶中DNA的变性和Southern转移探针的制备Southern杂交杂交结果的检测M1210×SSC转移缓冲液Whatman滤纸凝胶Whatman滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g12与探针同源杂交的基因DNA片段基因组DNADNA酶切片段内切酶NC或尼龙膜NC膜或尼龙膜•基因组DNA的定性与定量分析。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。•重组质粒和噬菌体的分析。Southertblotting用途（二）Northern印迹杂交利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称为Northern印迹杂交（Northernblotting）。Northern印迹杂交基本原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。Northern印迹杂交的基本过程相同点：名称相对于Southernblotting•转移的是RNA•转移前无需酶切•转移效率较高•变性方法不同点原理均为毛细作用Northernblotting用途•检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。•比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。二、蛋白质印迹技术(Westernblotting)蛋白质印迹技术是根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子对其进行检测。最常用的蛋白质是抗体，因此被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。与DNA和RNA印迹相似之处蛋白质的转移只有靠电转移蛋白质的检测以抗体作探针用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。与DNA和RNA印迹不同之处Westernblotting应用•检测样品中的特异蛋白质的存在•细胞中特异蛋白质的定量分析•蛋白质分子的相互作用研究三种印迹技术的比较Westernblotting垂直槽Northernblotting水平槽Southernblotting水平槽第2节PCR技术的原理与应用（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶链反应PCR技术是1985年由美国科学家KaryBMullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。PCR方法被美国Science杂志评为1989年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶被评选为象征1989年的“年分子”(themoleculeofyear)。5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、PCR技术的基本原理Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+PCR体系基本组成成分二、PCR技术的主要特点1.特异性强2.灵敏度高3.简便快速4.对标本的纯度要求低2.采用PCR方法获得目的基因引物选择：特异引物、随机引物、简并引物1.采用RT-PCR方法扩增目的基因三、PCR技术的主要用途（一）目的基因的扩增与克隆（二）基因的体外定点突变（三）基因突变分析（四）DNA和RNA的微量分析（五）DNA序列测定三、PCR技术的主要用途(Sanger双脱氧链终止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′双脱氧核苷三磷酸脱去DNA链末端合成终止法Sanger1958年和1980年两次获Nobel奖DNA链末端合成终止法DNA自动测序用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。DNA自动测序结果四、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术(RT-PCR)（二）原位PCR技术(ISP)（三）实时PCR技术(realtimePCR)RT-PCR技术AAnATTnT5′5′mRNA反转录酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1双链cDNA3′5′3′5′5′加热变性加入特异性引物DNA聚合酶PCR扩增出大量的产物实时PCR技术原理第3节转基因技术与基因剔除技术是指将外源基因整合到动物细胞或植物细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的技术。基因的导入方式主要：显微注射法胚胎干细胞法逆转录病毒感染法一、转基因技术即体细胞克隆技术，是用显微操作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。二、核转移技术核转移技术可使一个细胞变成一个个体，这样产生的个体所携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖的过程，即克隆(clone)。通过分子生物学的方法定向地敲除动物体细胞内的某个基因的技术称为基因剔除(geneknock-out)或基因打靶(genetargeting)。三、基因剔除技术四、基因转移和基因剔除在医学中的应用（一）建立疾病动物模型（二）生物制药（三）治疗性克隆和生产可用于人体器官移植的动物器官第4节生物芯片技术•DNA芯片(DNAchip)、DNA阵列(DNAarray)•cDNA芯片(cDNAchip)指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。一、基因芯片(genechip)将探针与荧光标记的待测样品分子进行杂交，通过检测系统检测杂交的荧光信号和强度，从而获取样品分子的数量和序列信息。将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片(proteinchip)又称蛋白质阵列(proteinarray)基本原理：蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。如抗体与抗原或受体与配体之间的特异性结合。最常用的探针：抗体，抗体与抗原结合的特异性最强。检测方法：标记检测法、直接检测法第5节蛋白质相互作用研究技术1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)。该系统的建立是基于对酵母转录因子Gal4分子的研究。转录激活因子DNA结合结构域(BD)(DNAbindingdomain)转录激活结构域(AD)(activationdomain)一、酵母双杂交系统（一）酵母双杂交系统的基本原理N端C端这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。（二）酵母双杂交系统的应用1.分析已知蛋白质之间的相互作用及蛋白质的功能结构域2.筛选和发现新的蛋白质3.筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响4.绘制蛋白相互作用系统图谱基因组学与蛋白质组学基因组学是研究生物体基因组的结构、结构与功能的关系、以及基因之间相互作用的科学包括基因组作图、核苷酸序列分析、基因定位、基因功能分析及调控研究等分为结构基因组学和功能基因组学一、基因组学的概念二、基因组学的研究内容（一）结构基因组学四张图谱遗传图谱物理图谱序列图谱转录图谱功能基因组学是建立在结构基因组学研究基础上的基因组分析主要包括：基因功能发现、基因表达分析、突变检测及模式生物研究等，并且这几方面都与生物信息学密切相关（二）功能基因组学蛋白质组学蛋白质组学是从整体水平研究细胞内蛋白质的组成、结构及其活动规律的科学。蛋白质组学是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究.一、蛋白质组学的概念二、蛋白质组学的研究内容总体上可以分为对蛋白质表达模式的研究即蛋白质组组成的研究和对蛋白质组功能模式（目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系）的研究两个方面