生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究

桂林理工大学生物工程专业技能实习报告1生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究学生姓名：指导教师：摘要：生姜蛋白酶是一种有待开发利用的新的植物蛋白酶。本实验对生姜蛋白酶的提取方法和纯化工艺进行了研究。实验中使用以乙醇或丙酮为溶剂的有机溶剂沉淀法和硫酸铵盐析法提取生姜蛋白酶，测定各方法提取物的蛋白含量和酶活性，确定最佳的提取方法。再通过双水相萃取和反胶束萃取两种方法纯化粗酶。双水相萃取是用PEG4000/硫酸铵、PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4两种双水相体系，反胶束萃取是用AOT/异辛烷、CTAB/正辛醇两种反胶束体系。关键词：生姜蛋白酶；有机溶剂沉淀法；硫酸铵盐析法；双水相萃取；反胶束萃取ResearchonextractionandpurificationofGingerproteaseStudent:GUOBo-huaTeacher:LIHai-yun,LIZi-yuan,LIUHong-yanAbstract:Gingerproteaseisapendingdevelopmentandutilizationofnewplantprotease.TheexperimentsonExtractionofgingerproteaseandpurificationprocesswereinvestigated.Withethanoloracetoneasextractionofgingerproteaseorganicsolventprecipitationandammoniumsulfatesaltingoutmethodusedintheexperiment,proteinandenzymeactivityoftheextracts,theoptimumextractionmethod.Thepurificationofcrudeenzymeofaqueoustwo-phaseextractionandreversemicellesextractiontwomethods.Aqueoustwo-phaseextractionwithPEG4000/ammoniumsulfate,PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4twoaqueoustwo-phasesystem,reversedmicellarextractionisusedAOT/isooctane,CTAB/octanoltworeversemicellarsystem.Keywords:Gingerprotease;organicsolventextraction;ammoniumsulfatesalting-out;aqueoustwo-phaseextraction;anti-micelleextraction桂林理工大学生物工程专业技能实习报告2前言生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋白酶在肉类嫩化、酒类澄清以及凝乳中均具有广泛的应用前景，开发潜力较大。生姜蛋白酶用于肉类嫩化，不仅可以显著提高肉的嫩度，而且可以使其具有良好的风味。生姜蛋白酶用于酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清度[1]。1968年，MiChi等人首先报道了生姜蛋白酶。1973年，Thompson等人从生姜根茎中提取了生姜蛋白酶，并命名为Zingibain，并指出它具有较高的最适温度(60℃)等特性，因此有较好的应用前景。同年，Ickikawa和Roshie等人用DEAE—纤维素柱层析对该酶进行了纯化，证明该酶是由两个组分(GP—1、GP—2)构成的，除电泳迁移率外，两个组分在其他方面基本相同；用SephadexG—100测得两个组分的分子量均为22500，该酶结晶为六面体。1978年，Ohtsuki、kozo等人用P—100生物胶过滤对该酶进行纯化，得出该酶分子量为29000。1995年，Ohtsuki发表论文，报道了用DEAE—Sepharose和SephadexG—75纯化生姜蛋白酶之后，用等电聚焦电泳可将该酶分为三个组分，并用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳和TSKG2000SW凝胶过滤再次证明该酶分子量为29000。同年，赵帜平等以安徽舒城的生姜为原料，采用DEAE—纤维素DE—52和SephadexG—75纯化得两个组分，用苯酚—硫酸法鉴定均为糖蛋白，并证明糖肽键型均为非O型。1999年，kyung等利用X—射线晶体衍射法研究了生姜蛋白酶2.1A精确度下的晶体结构。发表了以下重要研究成果：（1）生姜蛋白酶—Ⅱ是一个含有221个氨基酸残基的糖蛋白，在Asn99和Asn156上有两条N型寡糖链，糖基含量占8％，并阐明了寡糖残基的组成及连接方式。（2）生姜蛋白酶—Ⅱ总体结构类似于生姜蛋白酶等其他植物巯基蛋白酶，肽链折叠成两个独立的大小差不多的结构域，两者之间有一道裂隙，活性中心就位于裂隙中。（3）DTT对该酶有强烈的激活作用。（4）结晶为四聚体，阐明了单体间的连接方式。2002年，代景泉以莱芜生姜为原料，用硫酸铵沉淀法对生姜蛋白酶进行粗提，证明了生姜蛋白酶具有酸性蛋白酶的性质，并用DEAE—纤维素DE—52对该酶进行纯化，将该酶分为两个组分[2]。生姜蛋白酶目前广泛采用的提取方法主要有沉淀法和超滤法两大类，通常采用的沉淀剂主要是有机溶剂如丙酮和乙醇，盐类如硫酸铵，以及单宁等。沉淀法大都以丙酮粉作为酶的来源，沉淀剂对酶及蛋白质进行沉淀，从而将生姜蛋白酶从大量的杂质中分离出来，制成丙酮粉后还可以在低温下长期保藏，其性质十分稳定；唐晓珍首先报道了采用超滤法提取生姜蛋白酶，基本工艺如下：生姜→洗净→切碎→榨汁→离心除去淀粉→抽滤→超滤→取浓汁→真空冷冻干燥保存。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告3近几年的一些新的提取方法，则综合运用了上述各种方法，例如：2000年，Kyung在研究生姜蛋白酶的氨基酸序列时，采用如下的提取方法[5]：生姜切成小块，3℃下，在1000mL20mM7.0的磷酸缓冲液中研磨，混合物搅拌1h然后用纱布过滤，取滤液。滤渣再用500mL缓冲液浸提，过滤，合并滤液，加入2％的氯化钠，搅拌2h，在4℃下15000g离心30min。上清液用硅藻土过滤以除去悬浮物，然后加入硫酸铵至20％饱和度，将溶液搅拌1h，然后13000g离心30min，上清液继续添加硫酸铵至60％饱和度，用NaOH调节pH至7.2，4℃下搅拌3h，离心取沉淀，用约150mL20mMpH为7.0的磷酸缓冲液（含有5mM的连四硫酸钠）溶解。溶液用截流分子量为12000的透析袋对20mMpH为7.0的磷酸缓冲液（其中含有5mM的连四硫酸钠，1mMEDTA）透析16h以上。透析液在4℃下10000g离心30min以除去任何不溶性物质的粗酶液，并在此基础上进行层析纯化。又如：2005年，Adulyatham等在研究生姜蛋白酶的部分纯化和稳定性的时候采用如下的提取方法[6]：鲜姜，切片，与4倍（w/v）的冷Tris-盐酸缓冲溶液（0.05M,pH8.0）混合均匀，均质，四层纱布过滤，滤液在5℃，12000g的离心机中离心20min。上清液，即生姜蛋白酶，在5℃保存。生姜蛋白酶属大分子物质，在超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象，且存在生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及有机溶剂残留问题；盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强，制得的生姜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业上的放大生产，且用于亲和层析的前处理液是需经过初步纯化的酶液。相对来说，双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白酶[3]。胶束萃取是适合生化分离的新技术，成本低，溶剂可重复利用，萃取率和反萃取率都很高，条件温和，有可能解决外源蛋白的降解问题，不引起蛋白质和酶的变性，操作简便，构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，可直接从整细胞中提取蛋白质和酶[4]。对于反胶束酶系统的研究，主要集中于反胶束中酶的定位和结构、酶催化的动力学特征、酶的催化活性及稳定性等方面。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告41实验原理1.1有机溶剂沉淀蛋白质原理与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。1.2盐析法蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。1.3双水相萃取原理双水相萃取是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相的浓度不同。对于蛋白质，只要选择合适的双水相体系，控制一定条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的。1.4反胶束萃取原理表面活性剂在溶液中形成反胶束，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力，当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白的水溶液接触后，蛋白及其他亲水性的物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告52实验部分2.1材料、试剂与仪器2.1.2实验原料新鲜生姜。2.1.3主要试剂磷酸缓冲液（0.05mol/L,PH7.5）、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（0.05mol/L,PH6.0）、丙酮、聚乙二醇（40%PEG4000溶液）、40%硫酸铵溶液、20%PH6.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液、无水乙醇、AOT（0.05mol/L）、异辛烷、正辛醇、CTAB（0.05mol/L）、0.1mol/LKCl溶液、0.2MKCl溶液、0.4MKCl溶液、0.1MNaCl溶液、0.2MNaCl溶液、0.4MNaCl溶液、40%PBS缓冲液、牛血清蛋白溶液（0.1mg/mL）、盐酸（0.2mol/L）、1%酪蛋白、三氯乙酸（0.4mol/L）、考马斯亮蓝G-250溶液。2.1.4主要仪器紫外分光光度计、离心机、搅拌机、恒温水浴、移液管、天平、电子天平、冰箱、刻度试管。2.2实验方法2.2.1生姜蛋白酶的常规提取纯化工艺2.2.1.1生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50g，切成小块，按料液比1：2加入磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH7.5），研磨匀浆30min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置2h后，离心（4000rpm，10min）去除沉淀，上清液用磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH7.5）定容至100mL（生姜蛋白酶溶液A），4℃冰箱贮存待用。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。2.2.1.2乙醇沉淀法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入1.5倍的无水乙醇进行沉淀，4℃静置过夜后，离心（4000rpm，10min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0