生物PCR技术

第八章聚合酶链反应1985年PE-cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)。此技术能够特异地扩增任何所希望的目的基因或DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古等方面有重要的应用价值，并对分子生物学技术的发展给予巨大的推动。•第一节PCR原理与特点•第二节PCR类型•第三节PCR技术在医学上的应用一、PCR的基本原理在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增(图8-1)。㈠DNA模板变性双链DNA是通过94℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA。㈡模板与引物退火将合成的两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA两端的序列互补。通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。㈢引物延伸在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下，DNA聚合酶在最适作用温度可将单核苷酸从引物3′端掺入，沿模板延伸合成新股DNA，每一循环的产物可作为下一循环的模板。以上所述的变性、退火、延伸“三步曲”被确定为PCR的一轮循环，整个PCR过程一般需进行三十轮的循环。按2n的指数方式递增，PCR扩增量应达到230个拷贝，“平台效应”出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素。二、PCR技术的特点㈠高度的敏感性PCR产物的生成是以指数方式增加的，即使按75%的扩增效率计算，单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数也在100万以上，即可将极微量(pg级)DNA扩增到紫外光下可见的水平(g级)。㈡高度的特异性PCR扩增的特异性在很大程度上依赖于引物与模板的互补程度，即引物与模板结合的正确性。㈢操作简便、快速㈣适用样品广泛含微量(pg、ng)目的DNA或RNA的样品即可用作反应的起始材料。三、常规的PCR操作㈠反应体系标准PCR反应体积为50~100l，其中含有：1PCR反应缓冲液、四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、二种上、下游引物、DNA模板、TaqDNA聚合酶。㈡反应步骤四、PCR反应条件的优化㈠模板核酸PCR可以用DNA或RNA模板材料。但用RNA模板的扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。㈡引物引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸，两段引物分别与相应的一条DNA链3’端及5’端互补。引物设计一般遵循下列原则：(1)引物的序列应选定基因组DNA的高度保守区，以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。(2)引物的长度以15~40bp为宜。(3)引物的碱基尽可能随机分布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40%~75%之间。(4)引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应无回文结构。(5)二个引物之间不应有互补序列，以免形成“引物二聚体”，浪费引物。(6)引物5′末端碱基无严格限制，在与模板结合的引物长度足够的条件下，其5′端碱基互补程度无严格限制。(7)引物3′端的头1~2个碱基会影响TaqDNA聚合酶的延伸效率，从而影响PCR反应的扩增效率及特异性，因此选择合适的3′端碱基很重要。最好选T、C、G，不选A(8)引物的3′端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第3个碱基的摆动位置位于引物的3′末端。㈢耐热DNA聚合酶TaqDNA酶有良好的热稳定性，TaqDNA聚合酶在70~75℃时具有最高的生物学活性。㈣脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸(dNTP)是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总称，是靶DNA序列扩增的原料。dNTP浓度取决于扩增片段的长度、MgCl2浓度、引物浓度等反应条件。㈤缓冲液目前最为常用的缓冲液体系为10~50mmol/LTris-HCl(pH8.3~8.8,20℃)。㈥Mg2+Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+浓度过高则影响PCR反应的特异性。㈦添加剂PCR反应中加入一定浓度的添加剂如DMSO(二甲基亚砜)等可提高PCR扩增效率及特异性㈧PCR循环数30次是比较合理的循环次数，循环次数太少，产物的量不多；循环次数过多，则非特异性产物增加。㈨PCR易发生的问题及解决方法⒈没有得到所希望的PCR产物(假阴性)⒉所有样品均为阳性(假阳性)⒊PCR产物呈片状⒋出现非特异扩增第二节PCR类型一、不对称PCR(asymmetricPCR)不对称PCR的目的是扩增产生特异长度的单链DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。进行不对称PCR有二种方法：(1)一步法;(2)两步法，第一次PCR用等浓度的引物，以期获得较多的目的DNA片段，取第一次扩增产物(含双链PCR片段)用单引物进行第二次PCR扩增产生单链DNA。二、逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)RT-PCR先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板加入dNTP和两种特异引物及Taq酶进行PCR反应，这样低丰度的mRNA被扩增放大易于检测。RT-PCR中的关键步骤是RNA的逆转录，要求RNA模板必须是完整的，且不含DNA、蛋白质等杂质。三、锚定PCR(anchoredPCR,A-PCR)该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因配对互补结合后进行PCR扩增（图8-2）。四、反向PCR(inversePCR,IPCR)IPCR是扩增未知序列的一种简捷方法。其基础是：用限制性内切酶消化DNA，然后环化切割的产物，再用切割后已知序列上两端相反方向的引物序列进行PCR(图8-3)，也可将环化DNA线性化后再进行PCR。五、随机引物PCR(arbitraryprimerPCR,AP-PCR)RAPD建立在PCR基础之上，它是利用一系列不同的随机排列的寡核苷酸链(通常为十聚体)为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB染色来检测扩增DNA片段多态性。可用于进行基因组指纹图谱的构建，并利用指纹图谱进行品种鉴定和对物种进行亲缘关系和系统进化的研究。六、差异显示RT-PCR(differentialdisplayRT-PCR,DDRT-PCR)DDRT-PCR技术最大的优点是省去了cDNA克隆和随后繁杂的克隆筛选工作。但此方法也存在需要合成的引物多、费用大、操作技术要求高、虚假特异区带出现较多等缺点，仍有待进一步完善。如图8-4。七、单链构象多态性PCR(singlestrandconstructionpolymor-phismPCR,SSCP-PCR)其原理是单链DNA分子因单一核苷酸不同，其二级结构有所差异，PCR产物常表现在非变性凝胶电泳中电泳迁移率不同。通过比较DNA的电泳类型，即可测出突变。其优点是所需样品DNA量极少，灵敏度高，可检测出点突变，以及插入、缺失突变，能一次筛选多个样品。八、俘获PCR一种生物素标记的同已知序列互补的引物首先通过线性扩增延伸。而后，生物素标记的延伸产物，可被已包被链霉抗生素蛋白的固体支持物选择性地俘获。经几次洗涤，可去除所有未生物素化的DNA分子，经过这一步纯化，再进行指数扩增可大大降低非特异性扩增背景。九、多重PCR(multiplexPCR)多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段；如果被测基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常(图8-5)。多重PCR具有灵敏、快速特点，特别适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern杂交结果同样可靠，且多重PCR尚可检测小片段缺失。十、着色互补PCR(colorcomplementationPCR)该法的原理是用不同的荧光染料标记不同引物的5′端，如JoE、TAMRA及CouM等染料分别呈红、绿、蓝荧光。进行复合PCR，合成的目的DNA片段分别带有引物5′端染料的颜色以此来判定扩增产物的结果，若某一DNA区带缺失，则无对应染料标记的产物，据此可判定基因异常或发现感染的病毒等。十一、巢居PCR(nestedPCR,N-PCR)N-PCR是设计两对引物，一对引物对应的序列在模板的外侧，称外引物(outer-primer)，另一对引物互补序列在同一模板的外引物的内侧，称内引物(inter-primer)，即外引物扩增产物较长，含有内引物扩增的靶序列，这样经过二次PCR放大可将单拷贝的目的DNA片段检出。十二、半巢居PCR(heminestedPCR,HnPCR)HnPCR是巢居PCR与不对称PCR的结合，HnPCR是先用等量的外引物扩增，再用一个内引物扩增，产生大量单链内引物的产物，HnPCR比巢居PCR节省一个引物，又比不对称PCR的特异性及敏感性好。十三、二温式PCR标准PCR的一轮循环是由变性、退火、延伸三步组成的，在不影响PCR反应特异性和敏感性前提下，可将退火、延伸温度合并为一个温度，采用二温式PCR，即94℃变性，65~68退火延伸，这样既保证引物与模板结合特异性，又可使引物顺利延伸，与标准PCR相比，二温式PCR操作更简便、快速、特别适于临床检验。十四、增敏PCR(boosterPCR,BPCR)其基本方法是将标准PCR30轮循环分两次进行，第一次引物浓度仅为数十pmol/L，延长退火时间，进行20轮循环后，靶序列浓度大大提高，再将引物浓度增至0.1mol/L，同时缩短退火时间，再进行20轮循环。用BPCR检测EcoliBMI195耐红霉素基因(ereA)，可检出粪便标本中1~10个菌。十五、重组PCR㈠重组体的构建（图8-6所示）它的原理在于巧妙地设计和利用寡核苷酸引物，共进行二级PCR反应。在初级的两个PCR反应中，每对引物中的一个引物3′端与待重组基因互补，5′端与另一个待重组基因互补，即在引物的5′端加入一段序列作为接头。分别进行PCR，所得二种PCR产物有部分重叠序列，混合二种初级PCR产物进行次级PCR，经过变性和复性，二种PCR产物通过互补序列发生粘连，出现二种异双倍体产物。其中一种产物的3′末端单链可用TaqDNA聚合酶延伸，产生包含两个重叠产物全长的片段，作为PCR反应的模板。由此进行PCR扩增可产生一个包含两种基因的重组基因片段，该片段保持了密码子框架的正确性。㈡突变体的构建原理同重组体的构建相似。在靠近引物5′端人为造成引物与模板之间的碱基突变，插入或缺失。两个初级PCR产物均有PCR引物导入的同样的突变序列，因此有部分重叠序列，将二个初级PCR产物混合进行次级PCR，即可获得突变体片段如图8-7所示。十六、表达PCR(expressionPCR)表达PCR则是一种更加简便的体外转录翻译的方法。表达PCR是重组PCR的一种，将启动子序列(5′TAATACGACTCACTATA3′)和目的基因重组，产生重组DNA，PCR扩增含有启动子序列的目的DNA片段，可直接进行体外转录产生功能性的蛋白质。十七、竞争PCR(competitivePCR)该法的总策略是采用相同的引物，同时扩增靶DNA和已知浓度的竞争模板，竞争模板与靶DNA大致相同，但其内切酶位点或部分序列不同，用限制性内切酶消化PCR产物或用不同的探针进行杂交即可区分竞争模板与靶DNA的PCR产物，因竞争模板的起始浓度是已知的，通过测定竞争模板与靶DNA二者PCR产物便可对靶DNA进行定量。十八、原位PCR(In-situPCR)在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交即可检出含该特异序列的细胞。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增的方法