生物化学-质粒DNA测定实验报告

实验名称(TitleofExperimetn)质粒提取、定量与酶切鉴定实验日期(DateofExperiment)2015-11-17实验地点(LabNo.)第四实验室合作者(Partner)指导老师(Instructor)总分(TotalScore)XX教师签名(Signature)李某某批改日期(Date)2013-06-03【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】1．实验原理1）PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。2）碱裂解法提取质粒：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；在高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；但当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA能复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。离心层析柱：采用碱裂解法提取质粒，吸附柱内的硅基质质膜在高盐低PH状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其他细菌成分去除，最后低盐，高PH的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质上洗脱。3）质粒DNA定量测定-紫外光吸收法因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。而蛋白质的紫外吸收峰在280nm处。通过测定260nm和280nm的吸光度比值（A260/A280），可估计核酸的纯度。A260/A280的比值可以反应DNA的纯度•Ratio=1.8DNA样品较纯,符合实验要求；•Ratio＞1.9RNA污染；•Ratio＜1.6蛋白质或其它杂质的污染；4）质粒DNA的酶切鉴定限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具酶,可分为、、型。其中，II型识别和切割的核苷酸序列专一限制性核酸内切酶识别序列，其识别位点长度为4～6个核苷酸的回文序列。本实验中用到的两种酶类：EcoRⅠ和HindⅢ就是II型限制性核酸内切酶，可将质粒DNA割成不用大小片段。不同质粒DNA有不同的核苷酸序列，因而其酶切位点和数量也不同。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。迁移速率：共价闭环超螺旋DNA＞线性DNA＞开环的双链环状DNA2.实验材料1）样品：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α2）试剂：LB培养基（液体、固体）质粒提取试剂盒：溶液S1（细菌悬浮液）、裂解液S2、中和液S3、洗涤液W、洗脱液、RNaseA(100mg/ml)、DNA吸附柱HindIII核酸内切酶（TaKaRa）电泳实验上样缓冲液EcoRI核酸内切酶（TaKaRa）10×M酶切缓冲液：蒸馏水3）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅易瑞质粒小量提取试剂盒、微量移液器（20、100、1000μL）、1.5mL塑料离心管、塑料离心管架（30孔）、紫外检测仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、UVette比色皿等3.实验步骤1）碱裂解法提取质粒2）质粒DNA定量测定3）质粒DNA的酶切鉴定在一个洁净的0.5ml离心管中混匀下列反应物：反应物体积（µl)10×M酶切缓冲液2质粒DNA500~1000ng(10µl)HindIII1EcoRI1H2O至20混合后37℃水浴1～2h琼脂糖凝胶电泳：制备上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀。用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6µl盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。电泳条件：电压80v；时间25～30分钟；电泳结束后，切断电源，取出凝胶。电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带。取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。95μL蒸馏水紫外分光光度计测定A260/A280调零加5μL质粒ＤＮＡ加样枪调匀测定三组数据4.注意事项1）碱裂解法提取质粒DNA加入250μL裂解液S2不可过分用力振荡，避免染色体DNA因外力作用断裂成小片段，从而与质粒DNA混合在一起，引入误差。2）紫外分光度法测定酶切质粒DNA（1）拿UVette比色皿时，应注意拿着比色皿的粗糙面。最好在使用之前用干净的纸巾擦拭光学面。并且放比色皿时注意将光学面与出光方向一致。空白对照和样品应该在同一个比色皿中检测，以防误差。（2）在比色皿中稀释时，要用加样枪充分混匀并防止气泡和其他悬浮物的出现。（3）在酶切反应体系中，质粒DNA最后加入，以防止操作不当引起的试剂的污染，而且在混合后避免强烈振荡，保证不使内切酶变性及DNA分子的完整。3）质粒DNA的酶切分析（1）因为缓冲液具有致癌性，所以在混合缓冲液是一定到戴手套操作。若不慎沾到要立即用大量清水冲洗。（2）在离心管中混匀物质时，HindIII和EcoRI应最后加入。（3）水浴时应把管盖盖紧，避免水蒸气进入。【实验报告第二部分（实验记录）：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据。评分（满分20分）：XX】1.实验条件1）材料：由实验室提供2）试剂：规格用量严格按照操作步骤中的要求进行2.实验现象1）碱裂解法提取质粒DNA加入中和液S3之后，管内出现絮状白色沉淀。离心后沉淀于底部，上清液呈无色透明。2）紫外分光度法测定酶切质粒DNA：三次测量结果如下图3）质粒DNA的酶切分析电泳完毕之后，利用紫外检测仪和凝胶成像仪观察电泳条带，并拍照得到以下图片：标志如下图3.原始数据测量次数质粒DNA浓度（ug/ml）Ratio比值(A260/A280)156.41.80256.61.76355.81.83平均值56.31.80开环的双链环状DNA线性DNA共价闭环超螺旋DNA酶切DNA【实验报告第三部分（结果与讨论）：①结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；②讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。③结论：简单扼要，说明本次实验所获得的结果。（包括思考题）。评分（满分45分）：XX】1．结果由紫外分光度法测定酶切质粒DNA，dsDNA浓度为约为56.3ug/ml，Ratio比值(A260/A280)为1.80。酶切DNA：2000pb质粒DNA中出现三条带，从下到上（远到近）的顺序为：超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。2.讨论1）由Ratio比值(A260/A280)均值为1.80可知DNA样品较纯,符合实验要求。实验操作比较规范没有出现大差错。但是并不是每次实验结果都是1.80，所以也有一定的操作失误：在混合后马上测定DNA的浓度，没有用加样枪充分混合均匀。也就是说在溶液混合的过程中，没有等到溶液充分混匀、静置就直接测定了DNA的浓度，使得第二组比值偏低。向菌种加S1时，振荡不充分，导致有少量细胞贴于管壁，未破裂，致使提取的DNA减少，第二组比值偏低。比色皿的光学面使用过度，存在老化，模糊的杂质贴在壁上，影响了测量的精度。2）超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA这三种不同构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。但是从图像可以看出，此次实验结果虽然正常出现，但加样并不均匀，导致电泳结果并不是明显的条带状，而是点状。3.结论DNA样品较纯，酶切DNA为2000pb，质粒DNA迁移速率由大到小为超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。