生物反应工程原理

生物反应工程的定义生物反应工程是一门以研究生物反应过程中带有共性的工程技术问题的学科。是以生物学、化学、工程学、计算机与信息技术等多学科为基础的交叉学科。生物反应过程与化学反应过程本质的区别是有生物催化剂参与反应。特点：1）反应在温和的条件下进行；2）反应速率比化学反应过程慢很多；3）反应的复杂性有时难于预计。共性的基本问题：1）反应过程的定量；2）动力学研究；生物反应过程的四个组成部分①原材料的预处理及培养基的制备；②生物催化剂的制备；③生物反应器及反应条件的选择与监控；④产物的分离纯化工程；生物反应工程的研究内容1、生物反应动力学生物反应动力学主要研究生物反应速率和影响反应速率的各种因素。基本内容：1）酶反应动力学的特点、均相和多相系统酶促反应动力学及酶的失活动力学；2）微生物反应过程的质量与能量衡算、发酵动力学和微生物的培养操作技术；3）影响动植物细胞反应的因素、动植物细胞反应及反应动力学。2、生物反应器生物反应器是使生物技术转化为产品和生产力的关键设备。1）生物反应体系中的流变学特性、氧的传递与微生物呼吸、体积溶氧系数及相关因素、溶氧方程及溶氧速率调节；2）酶反应器及设计、机械搅拌式发酵罐及设计、气升式生化反应器设计、生物废水处理设备及动植物细胞培养用反应器等；3）分批、流加和连续式操作，及动植物细胞培养技术等。3、生物反应过程的放大与缩小1）探讨各种类型生物反应的内在规律；2）从概念上注意与相关学科的区别；3）要全面、深入地看待问题；4）确立评价生物反应过程的标准。酶的分类与命名酶：是生物体为其自身代谢活动而产生的生物催化剂，经典的酶学理论认为酶是蛋白质催化剂，具有蛋白质的一切性质。氧化还原酶（oxido-reductase）；转移酶（transferase）；水解酶（hydrolase）；裂合酶（lyase）；异构酶（isomerase）；合成酶（synthetase,ligase）酶的功能酶作为催化剂的共性：①降低反应的活化能；②酶可加快反应速率；③不能改变反应的平衡常数，只能加快反应达到平衡的速度；④反应前后酶本身不变；酶的生物催化特性：①酶有较高的催化效率；②酶有很强的专一性；一种酶仅能作用于一种物质或一类结构相似的物质进行某一种反应，这种特性称为酶的专一性或选择性。（1）绝对专一性；（2）相对专一性；（3）反应专一性（reactionspecificity）；（4）底物专一性（substratespecificity）；（5）立体专一性（stereospecificity）；（6）官能团专一性（functionalgroupspecificity）；（7）序列专一性；③酶有温和的反应条件；酶催化反应的温度一般在生理温度25～37℃范围，近中性pH值条件。催化效率的表示法：（1）酶活力：在特定的条件下（25℃，在具有最适底物浓度、最适缓冲液离子强度和pH）下，1min能催化1μmol底物转化为产物时所需要的酶量，称为一个国际单位，用IU表示。（2）1972年国际酶学委员会推荐的新酶活力国际单位Katal，符号Kat，即，在最适条件下，1s催化1mol底物转化的酶量。1Kat=1mol/s=6×107IU1IU=1umol/min=16.67×10-9Kat（3）酶的比活力:指每1kg酶所具有的Kat数，即Kat/kg。酶的另一个重要特点是它们常需要辅因子的共同作用，辅因子是非蛋白化合物，它与非活性蛋白结合形成有催化活性的复合物称为酶。辅因子有三类：（1）金属离子（激活剂）；（2）辅酶；（3）辅底物；酶以活力，而不是以纯度和质量购销。酶活力测定：通过测定初始短时间内底物的消耗量或产物的生成量进行酶活力的测定。固定化酶（固相酶或水不溶酶）：是通过物理或化学方法使溶液酶转变为在一定的空间内运动受到完全或局部约束的一种不溶于水，但仍具有活性的酶。能以固相状态作用于底物进行催化作用。主要优点：反应后很容易分离出来。固定化酶大多数情况下稳定性增加。实现生产连续化和自动化。固定化酶性质变化表现1）底物专一性改变2）稳定性增强3）最适pH和最适温度改变4）动力学常数变化速率（rate）：指变化快慢程度，包含反应速率和传质速率。反应速率（reactionrate）：单位时间、单位反应体积生成的产物量。传质速率（transferrate）：单位面积上单位时间的传递量。速度（velocity）：指运动物体运动的快慢。影响固定化酶动力学的因素(1)空间效应构象效应：在固定化过程中，由于存在着酶和载体的相互作用从而引起酶的活性部位发生某种扭曲变形，改变了酶活性部位的三维结构，减弱了酶与底物的结合能力。位阻效应：载体的存在又可产生屏蔽效应，或称为位阻效应。(2)分配效应：当固定化酶处在反应体系的主体溶液中时，反应体系成为固液非均相体系。由于固定化酶的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定化酶载体内部底物或产物浓度与溶液主体浓度不同的现象。(3)扩散效应：固定化酶对底物进行催化反应时，底物必须从主体溶液传递到固定化酶内部的催化活性中心处，反应得到的产物又必须从酶催化活性中心传递到主体溶液中。包括分子扩散和对流扩散。2酶促反应动力学2.1.2酶的稳定性及应用特点酶是以活力、而不是以质量购销的。酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更高的酶。2.1.3酶的应用研究与经典酶学研究的联系与区别经典酶学研究中，酶活力的测定是在反应的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机制。工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机溶剂中进行。2.2均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学是以研究酶促反应机制为目的发展起来的。作为酶工程技术人员，如果仅仅比较详细地解释了酶促反应机制和过程是不够的，还应对影响其反应速率的因素进行定量的分析，建立可信赖的反应速率方程，并以此为基础进行反应器的合理设计和确定反应过程的最佳条件。因此，以讨论反应机制为目的的酶促反应动力学与为了设计与操作反应器的工业酶动力学，在研究方法上自然不同。这与化学中的反应动力学和工业上的化学反应动力学的不同一样。2.2.1酶促反应动力学基础可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。对酶促反应QPBAk，有：BAPACkCrrr（2－1）dtdCrAA（2－2）dtdCrPP（2－3）式中，k：酶促反应速率常数；r：酶促反应速率；rA：以底物A的消耗速率表示的酶促反应速率；rP：以产物P的生成速率表示的酶促反应速率。对连锁的酶促反应，如PMAkk21，有：AAkCdtdC（2－4）MAMCkCkdtdC21（2－5）MPCkdtdC2（2－6）2.2.2单底物酶促反应动力学（米氏方程）单底物不可逆酶促反应是最简单的酶促反应。水解酶、异构酶及多数裂解酶的催化反应均属此类。对单底物酶促反应PS，根据酶－底物中间复合物假说，其反应机制可表示为：PEESSEkkk211下面我们分别采用快速平衡法和稳态法推导其动力学方程。快速平衡法：几点假设：（1）CSCE，中间复合物ES的形成不会降低CS。（2）不考虑EPPE这个可逆反应。（3）ESSEkk11为快速平衡，PEESk2为整个反应的限速阶段，此ES分解成产物不足以破坏这个平衡。根据以上假设，建立动力学方程：ESCkr2（2－7）11kkKCCCSESSE（2－8）ESEECCC0（2－9）解之，得SSSECKCCkr02（2－10）令02maxECkr，（2－11）则SSSCKCrrmax（2－12）稳态法：几点假设：（1）CSCE，中间复合物ES的形成不会降低CS。（2）不考虑EPPE这个可逆反应。（3）CSCE中间复合物ES一经分解，产生的游离酶立即与底物结合，使中间复合物ES浓度保持衡定，即0dtdCES。根据稳态法假设建立动力学方程：ESCkr2（2－13）0211ESESSEESCkCkCCkdtdC（2－14）ESEECCC0（2－15）解之，得SSECkkkCCkr12102（2－16）令02maxECkr，121kkkKm（2－17）则SmSCKCrrmax（2－18）上式即为通常所说的米氏方程。米氏方程可用图形表示：讨论：（1）当CSKm时，SmCKrrmax，属一级反应。（2）当CSKm时，maxrr，属零级反应。（3）当CS＝Km时，2maxrr。Km在数量上等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。Km和rmax的测定方法LinewearBurk法，即双倒数法。对米氏方程两侧取倒数，得SmCrKrr111maxmax。以SCr1~1作图，得一直线，直线斜率为maxrKm，截距为max1r。根据直线斜率和截距可计算出Km和rmax。rrmaxrmax/2KmCS图2－1酶浓度一定时反应速率与底物浓度的关系图2－2双倒数法求解Km和rmax2.2.3温度对酶促反应速率的影响温度对酶促反应速率的影响，是通过影响k2和KS（mK）实现的。)exp(2RTEaAkArrhenius方程（2－34）)exp(RTHKSVan’t-Hoff方程（2－35）值得注意的是Arrhenius方程仅在较低温度下适用于酶促反应。过高的温度将导致酶的失活（见教材P23图2-4）。（2－35）式中H为反应热。2.2.4抑制剂对酶促反应速率的影响首先应搞清失活作用与抑制作用的异同。失活作用：指物理或化学因素部分或全部破坏了酶的三维结构，引起酶的变性，导致酶部分或全部丧失活性。抑制作用：指酶在不变性条件下，由于活性中心化学性质的改变而引起酶活性的降低或丧失。凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称做酶的抑制剂(inhibitor)。使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。2.2.4.1竞争性抑制－1／Km1／rmax1／r斜率－Km/rmax1／CSEIS图2－3竞争性抑制作用示意图反应机理：PEESSEkkk211（2－36）EIIEIK（2－37）采用快速平衡法推导动力学方程：ESCkr2（2－38）SESSEKkkCCC11（2－39）IEIIEKCCC（2－40）EIESEECCCC0（2－41）解之，得SIISSCKCKCrr)/1(max（2－42）式中，02maxECkr，11kkKS采用稳态法推导动力学方程：ESCkr2（2－43）0211ESESSEESCkCkCCkdtdC（2－44）0EIiIEiEICkCCkdtdC（2－45）EIESEECCCC0（2－46）解之，得SIImSCKCKCrr)/1(max（2－47）式中:02maxECkr，121kkkKm令)/1(IImmKCKK，（2－47）式可变形为SmSCKCrrmax（2－48）式中mmKK将（2－48）式与米氏方程比较，可知最大反应速率测有变化，而Km增大。以SCr1~1作图，得一直线，直线斜率为maxrKm，截距为max1r，如图2－3所示。图2－4竞争性抑制作用下SCr1~1曲线2.2.4.2非竞争性抑制图2－5非竞争性抑制作用示意图反应机理：PEESSEkkk211（2－49）EIIEIK（2－50）ESIIESIK（2－51）ESI1／r1／CS1／rmax-1／Km-1／Km’CI=0CI采用快速平衡法推导动力学方程：ESCkr2（2－52）SESSEKkkCCC11（2－53）IEIIEKCCC（2－54）IESIIESKCCC（2－55）EIESEECCCC02－56）解之