生物工程专业毕业设计开题报告

燕山大学本科毕业设计（论文）开题报告课题名称：皮皮虾RAPD分子标记的多态性初步研究2013年3月20日一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:1.国内外研究现状DNA分子水平多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990年，Williams和Welsh等人运用随机引物扩增寻找的多态性DNA片段用作分子标记，并将此技术命名为RAPD（randomamplifidpolysnorphicDNA），即随机扩增多态性DNA。尽管RAPD技术诞生的时间不长，但由于其丰富的DNA多态性及快速、简便等特点，使它成为目前植物育种研究工作采用最多的手段[2]。随机扩增多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA），是以PCR为基础，以随机的短核苷酸序列为引物，以实验材料基因组DNA为模板，进行PCR反应，找出扩增片段的多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此需单独对每一随机引物进行PCR，如果引物结合部位的核苷酸序列发生了变化，或者扩增范围内碱基出现插入或缺失，DNA重排，就会导致原来结合位点的消失或产生新的结合位点，或者使扩增片段的长度发生改变，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色就检测出基因组所发生的变化。[1-4]与其他分子标记技术相比，RAPD具有以下优越性：RAPD所用引物为随机引物，一套引物可用于不同植物基因组分析，且不需预先知道待扩增基因的核苷酸顺序，试验费用较低。RAPD技术的多态性位点是无限的，灵敏度高，能够检测出品种间的微小差异。RAPD实验中所需DNA样品量少，纯度要求不高，实验过程中一般不需要进行South－ern转移、分子杂交等一系列繁琐的程序，可一次检测大量样品。同时，RAPD不需要使用同位素，减少了对工作人员的危害。RAPD产物，经过克隆和序列分析后，可作为RFLP和原位杂交的探针，在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。但RAPD分子标记技术也存在着一些缺点，一是标记大多是显性标记，二是实验稳定性一般。但许多研究表明，这些缺点是可以克服的。通过在实验中对RAPD技术体系进行优化，严格控制试验条件，并进行重复试验即可得到理想的结果。[7,8]2.选题依据及意义此毕业设计的课题为《皮皮虾RAPD分子标记的多态性初步研究》，主要是对皮皮虾组织总DNA进行离提取，运用RAPD分子标记的方法检测其多态性并进行初步研究。大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳提取与标记条件，并对其不同器官组织的多态性以及相同时期不同组织的多态性进行初步研究，同时得出最佳提取与标记方案。本设计利用目前广泛应用的RAPD分子标记检测DNA多态性的方法，利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。同一组织的分子标记揭示来自DNA的变异，随着分子生物学技术的发展，对皮皮虾的遗传育种、基因组作图、基因定位、亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面具有重大意义。二、研究的基本内容，拟解决的主要问题1.皮皮虾组织中总DNA的提取条件的进一步优化；2.通过分子标记，计算秦皇岛皮皮虾的基因分布特征；3.皮皮虾不同组织基因组特定区域DNA的多态性分析。三、研究步骤、方法及措施1.实验材料1.1皮皮虾1.2主要试剂RAPD引物：百盛（SBS）公司设计的RAPD引物Taq酶10xPCR缓冲液MgCl2：25mmol/LdNTP：2.5mmol/L2.实验方法2.1从微量组织中提取总DNA2.1.1取一小块冰冻的组织（少于1mg，可用经消毒的枪头钻取），或1～3根带有毛根的毛发（需先经90％、70％的乙醇和灭菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或1～5μl血液，加入经过高温消毒的离心管中。离心管内事先加入500μl5％的Chelex溶液。2.1.2将样品管在56℃下放置1小时或更长时间，直至组织样品成粉末状（不同组织所需时间各不相同）。2.1.3在振荡器上振荡10～15秒钟。2.1.4在95～100℃下煮15～40分钟。2.1.5在振荡器上振荡10～15秒钟。2.1.6将样品管在4℃下保存，进行PCR反应之前再次离心，使Chelex颗粒沉淀。取上清液（1～10μl）作为DNA模板。2.2RAPD分子标记2.2.1在15ul反应体系中，加入模板DNA1ul(30-50ng)；RAPD引物1ul(约5pmol)；10xPCRBuffer1.5ul；MgCl21ul；dNTP1ul；Taq酶0.5单位（U）；加ddH2O至15ul；混匀稍离心,加一滴（约20ul）矿物油。2.2.2在PCR仪中预变性94℃2分钟,然后循环:94℃1分钟，36℃1分钟，72℃1分钟，共40轮循环。2.2.3循环结束后,72℃10分钟，4℃保存。2.2.4在15ulPCR产物中加2ul上样缓冲液(6x)于1.6%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100V。2.2.5电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。2.2.6用凝胶成像仪观察、拍照。四、研究工作进度1-3周查阅相关文献资料，设计试验方案，写开题报告，任务书和文献综述；4-8周配制试剂、从微量组织中提取总DNA；9-14周RAPD分子标记，观察DNA片段长度，分析其多态性；15-16周分析结果；撰写毕业论文；17周论文评阅、答辩。五、主要参考文献[1]刘晓宇.RAPD分子标记技术概述及应用.应用技术,2010,11(9):57-59.[2]ToshiharuHashizume,IkuhiroShimoto,YoshiakiHarushi-ma,etal.Constructionflanatusmapforwatermelon(Citrul-lusMatsum)usingrandomamplifiedpolymorph:cDNA(RAPD)[J].Euphytica,1996,90:265-273.[3]陈亮,王平盛,山口聪.应用RAPD分子标记鉴定野生茶树种质资源研究[J].中国农业科学,2002,10:23-27.[4]任瑞文,卢强,徐晓立.提高RAPD稳定性的几点经验与探讨[J].生物技术.2001,02:7-10.[5]韩斌,张林丰.现代生物化工中酶工程技术研究与应用.北京农业,2008,(33):37-39.[6]王伟继;孔杰;董世瑞;栾生;王清印.中国明对虾AFLP分子标记遗传连锁图谱的构建[J].动物学报.2006,03:465-470.[7]宋铭晶,张知彬,徐来祥.动物种群遗传多态性研究中的PCR技术[J].动物学杂志.2003,01:293-296.[8]李联泰,安贤惠.几种海水经济贝类DNA提取方法探讨[J].淮海工学院学报(自然科学版).2005,04:264-267.[9]张宁,王凤山.DNA提取方法进展[J].中国海洋药物.2004,02:591-594.[10]RaiSK,MukheljeeAK.DevelopmentofanEfficientMethodforExtractingTotalDNAofIntestinalMicroflora[J].AnimalHusbandryandFeedScience.2011,03:55-59.[11]陈子桂,容丽,宋微波.海洋尾丝虫(Uronemamarinum)的DNA微量提取研究[J].动物学报.2001,S1:7574-7575.[12]王明森,王洪光,黄倢.水产动物病毒性疾病样品的采集和检测[J].动物医学进展.2009,08:710-715.[13]T.W.Vahlenkamp,H.K.Enbergs,H.MuÈllerExperimentalandnaturalbornadiseasevirusinfections:presenceofviralRNAincellsoftheperipheralblood.JournalofChemicalTechnology&Biotechnology,2000,5(2):112-116.[14]李睿,鲁志松,乔琰,姚汉超,于非非,杨旭.甲醛对DNA损伤的彗星实验研究[J],实验生物学报,2004,04::1399-1400.[15]王春琳,叶选怡,丁爱侠,母昌考.虾蛄繁殖生物学与繁育技术研究[J].海洋湖沼通报.2002,03(5):3-4.[16]叶惠忠,陈道才,徐水祥.虾蛄蛋白浆的制备及营养价值分析[J].浙江省医学科学院学报.2006,01(2):151.六、导师意见指导教师（签字）年月日七、审核意见：审查结果：1、通过；2、完善后通过；3、未通过负责人（签字）：年月日