生物技术制药重点

重点（单选10个，名词解释4个，简单3个，论述2个。）1.生物技术制药飞速发展的30年20世纪70年代中期生物时代（重组DNA、DNA的合成、DNA和蛋白质的微量测序技术、重组蛋白、单克隆抗体人胰岛素）20世纪80年代中期技术平台时代（新平台：高通量筛选、组合化学、胚胎干细胞技术，药物的探索性研究、治疗的新模式：反义药物、基因治疗以及在治疗中添加使用重组蛋白、胰岛素、干扰素、EPO、细胞集落刺激因子（CSF）、人生长激素等）20世纪90年代中期基因组时代（新技术：基因组、高通量的测序、基因芯片、生物信息、生物能源、生物光电、生物传感器、蛋白质组学和功能基因组学等制药工程，新药研发）2006年后基因组时代2.质粒三要素、基因工程制药流程、蛋白质纯化技术质粒载体的三个要素（1）复制子:又称复制起始区（2）选择标记：用于筛选鉴定(3)多克隆位点:限制性内切酶识别序列基因工程制药流程:1.目的基因的制备2.载体3.载体与目的基因的连接4.重组DNA导入宿主细胞5.重组子的筛选和鉴定6.细胞表达系统的选择7.基因重组蛋白的分离和纯化基因重组蛋白的主要纯化技术1.离子交换层析利用蛋白质等电点的差异，通过带电的溶质分子与离子交换剂中可以交换的离子进行交换离子交换剂阴离子交换剂、阳离子交换剂、两性离子交换剂、选择性离子交换剂影响因素盐离子浓度、离子大小、洗脱梯度与流速2.亲和层析利用固定化配基于目的蛋白之间特异的生物亲和力进行吸附•酶与激活剂/受体/底物•抗体与抗原•受体与激素/配体•蛋白质与DNA/RNA结合域亲和层析步骤：•配基固定化•亲和吸附•洗涤•洗脱解离•再生3.凝胶过滤4.反相层析和疏水层析•反相层析：有机溶液洗脱，蛋白质可能变性•疏水层析：盐溶液洗脱3.动物细胞培养常用溶液、培养基、生产用动物细胞动物细胞培养基是维持动物组织及细胞在体外生存、生长的基本的营养物质。1．天然培养基：直接采用取自动物体液或组织中提取的成分作培养液，如乳蛋白水解物、酪蛋白水解物、血清、血浆及胚胎浸出液等(维持液：含低浓度或不含小牛血清/生长液：含5％～20％小牛血清)2．合成培养基：化学成分主要为氨基酸、碳水化合物、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素及缓冲剂等。(Eagle培养基含有13种氨基酸、9种维生素、6种无机盐及葡萄糖；199培养基含21种氨基酸、17种维生素、7种无机盐、4种嘌呤、2种嘧啶、谷胱甘肽、ATP、胆固醇、吐温-80、脱氧核糖、核糖、葡萄糖及醋酸钠。)3．血清培养基：不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基无血清培养基:在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素、表皮生长因子等3．无血清培养基(serum—freemedium)第一代不含有血清，但含有大量的动物或植物蛋白第二代完全不用动物来源的蛋白质，蛋白质含量很低(少于100g/ml)，使重组蛋白的纯化简单第三代完全不含有蛋白质或含量极低，没有任何动物、人类蛋白或多肽新一代无血清、无蛋白质、无动物来源、成分确定动物细胞培养常用的其他溶液1．平衡盐溶液2．培养基pH调整液3．细胞消化液4．抗生素溶液1．平衡盐溶液生理盐水葡萄糖维持细胞渗透压、调控培养液酸碱度平衡酚红指示剂pH黄/紫红Hanks液缓冲能力弱Earle液缓冲能力强2．培养基pH调整液合成培养液微酸性，需调整pH单独配制，单独灭菌，待灭菌后的培养基使用前再加入3.7％、5.6％、7.4％NaHCO3溶液、羟乙基哌嗪乙磺酸液3．细胞消化液(1)胰蛋白酶溶液：分离自牛、猪等动物胰脏的胰蛋白酶(trypsin)呈黄白色粉末状，极易潮解，注意冷藏干燥保存.常用1:125和1:250两种浓度(2)EDTA溶液：一种化学螯合剂，其溶液又称Versen液，对细胞具一定的非酶性解离作用。常用浓度0.02％(个别细胞系要求浓度较高)使用完，需用Hanks液冲洗净(血清对其无终止作用)4．抗生素溶液防止发生微生物污染青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素生产用动物细胞的种类1．原代细胞：直接将动物组织或器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞(需要大量的动物组织原料、不能直接从细胞库获得、生长分裂不旺盛)2．传代细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤，从多种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系(在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处/有时是从肿瘤细胞衍生而来/从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养50代，且无致瘤性/广泛用于人用治疗性药物的生产，不够理想)3．转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖的能力得到的细胞系(大规模工业化生产)(无限的生命力/较短的倍增时间/较低的培养条件要求Vero(正常成年非洲绿猴肾细胞)、CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)、Namalwa细胞(淋巴瘤细胞)和BHK-21细胞(幼鼠肾细胞))4．工程细胞系：采用细胞融合技术或基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系(1)融合细胞系：通过动物细胞融合技术构建(2)基因工程细胞系：通过表达载体的构建、表达载体的导入以及表达细胞株的筛选而构建4.抗体的结构、抗体的种类、嵌合抗体、人源化抗体基本结构：抗体单体由4条多肽链（2条相同的重链和2条相同的轻链）通过二硫键（-S-S-）链接而成，为“Y”字形结构。1.轻链（L链）2.重链（H链）3.可变区（V区）:识别并特异性结合抗原：与毒素结合可以中和其毒性/与病原体结合，可以组织其对机体细胞的黏附和感染恒定区（C区）:1.激活补体系统抗体（IgM、IgG）与抗原结合形成复合物可通过启动C1q激活补体经典途径；IgG4、IgA和IgE的聚合物可以激活补体旁路途径。2.介导免疫细胞活性抗体的调理作用；ADCC作用；介导超敏反应3.穿过胎盘与黏膜IgG是唯一能够从母体通过胎盘屏障转运到胎儿体内的抗体（胎儿抗感染）分泌型IgA合成和主要作用部位在黏膜（黏膜局部抗感染）4.超变区（HVR），又可称为互补决定区（CDR）骨架区（FR）5.铰链区6.抗原特异性结合部位7.补体结合位点8.巨噬细胞等的结合位抗体的种类：Fab和Fv、单链抗体、双链抗体、抗体融合蛋白、嵌合抗体、人源化抗体、超变区多肽、特殊抗嵌合抗体:是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达的抗体，表达的抗体轻重链V区是异源，而C区是人源的，即整个抗体分子60%-70%是人源的。人源化抗体：把鼠抗体的CDR序列一直到人抗体的可变区内，所得的抗体。5.疫苗的种类、各种亚单位疫苗1.灭活疫苗2.减毒活疫苗3.亚单位疫苗4.联合疫苗5.核酸疫苗6.治疗性疫苗灭活疫苗又称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持其免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。疫苗液中除含有灭活的病毒颗粒外，还含有细胞成分和培养病毒时加入的牛血清等蛋白类物质，多次接种疫苗容易发生过敏反应。灭活疫苗的优点制造工艺简单免疫原性的稳定性高易于制备多价疫苗灭活疫苗的缺点需要严格的灭活操作，保证疫苗中不含有灭活不完全的颗粒。需要进行多次接种，由于机体反复接受疫苗中的异性蛋白质的刺激，而可能出现不良的过敏反应。接种灭活疫苗产生的抗体滴度随时间而下降灭活疫苗需要量大减毒活疫苗又称弱毒疫苗，是指将微生物的自然强毒株通过物理、化学和生物学的方法，连续传代，使其对原宿主丧失致病力，或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性、遗传特性，用这种毒株制备的疫苗就叫减毒活疫苗。减毒活疫苗的作用机制最类似自然感染免疫，因而具有类似自然感染的优越性。当前使用的病毒疫苗多数是减毒活疫苗。常用的减毒方法：体外减毒::::::即体外连续传代减毒。在异源宿主中连续传代；在单一宿主中反复连续传代。冷适应筛选温度可以改变病毒的特性，得到冷适应株。病毒冷适应株常伴有毒力减弱和各种特征性标志。冷适应筛选稳定的减毒突变株是在传统疫苗设计中较早采用的方法，而且也是最为行之有效的思路。减毒活疫苗的优点1）可以诱导更全面的免疫应答2）可诱导较强的免疫反应，理论上只需要接种一次3）可能引起水平传播，扩大免疫效果4）生产工艺简单，价格低廉。减毒活疫苗的缺点1）有可能出现毒力回复2）可能造成环境污染而引发交叉感染等，并可能滞留在环境中形成传染源3）产品的分析评估较为困难4）保存、运输条件要求较高亚单位疫苗是指提取或合成细菌、病毒外壳的特殊蛋白结构，即抗原决定簇制成的疫苗，这类疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物质，故称亚单位疫苗。亚单位疫苗仅有几种主要表面蛋白，因而能消除病毒（或细菌）的许多无关抗原决定簇和粗制或半提纯的病毒（或细菌）制剂诱发的不良反应。亚单位疫苗：纯化亚单位疫苗合成肽亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗合成肽亚单位疫苗（Syntheticpeptidesubunitvaccine）合成肽疫苗是指使用化学方法合成能够诱发机体产生免疫保护的多肽制成的疫苗。优点：①纯度和安全性高；②副作用小；③可长期在常温下保存；缺点：①其抗原性单一；②免疫原性弱。因此须用几种合成肽抗原联合使用，还须用多种方法提高合成肽的免疫原性。灭活疫苗减毒活疫苗亚单位疫苗制备方法通过化学或物理方法使病原体失活通过非正常培养选择减毒株或无毒株以化学方法获得病原体的某些具有免疫原性的成分免疫机理病原体失去毒力但保持免疫原性，接种后产生特异抗体或致敏淋巴细胞接种后病原体在体内有一定生长繁殖能力，类似隐性感染，产生细胞、体液和局部免疫接种后能刺激机体产生特异性免疫疫苗稳定性相对稳定相对不稳定稳定毒力回升不可能有可能不可能免疫接种多次免疫接种一般为一次性多次免疫接种安全性较安全对免疫缺陷者有危险安全性好常用疫苗乙脑、脊髓灰质炎麻疹、脊髓灰质炎减毒白喉、破伤风类毒灭活疫苗活疫苗素，A群脑膜炎球菌多糖疫苗基因工程亚单位疫苗：是指在分离出病原体特异抗原编码基因的基础上，将外源基因转入另一个非致病性的微生物内表达基因产物，然后通过分离和纯化而获得特异性的蛋白质。基因工程亚单位疫苗的优点：①产量高；②纯度高；③安全性高；④用于病原体难于培养或有潜在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。基因工程亚单位疫苗的缺点：与传统亚单位疫苗相比，免疫效果较差。增强其免疫原性的方法：①调整基因组合使之表达成颗粒性结构②在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球③加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂（adjuvant）。6.固定化酶的性质和指标、有机相的酶反应固定化酶性质的改变：1.酶活力的改变：固定话酶活力小于天然酶，专一性也会发生改变2.酶稳定性的提高：热稳定性3.酶最适合PH改变：负电荷载体制备的固定化酶，最适pH提高；反之亦然4.酶最适温度提高5.米氏常数KM变化指标：1.固定化酶（细胞）的活力酶催化某特定化学反应的能力，可表示为一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度。单位：每毫克干重固定化酶（细胞）每分钟转化底物（或生产产物）的量，表示为mol/(min.mg)2.偶联率及相对活力的测定：用以表示影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活固定化酶的活力回收是指固定化以后固定化酶（或细胞）所显示的活力占被固定的等量游离酶（细胞）总活力的百分数3.固定化酶（细胞）的半衰期在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示是衡量操作稳定型的指标，而操作稳定性是影响实用的关键因素。4.固定化酶的热稳定性将固定化酶在不同温度下温育1h之后，在最适温度下测定酶活力，固定化酶的活力一般应保持在60%以上。为什么采用有机相进行酶反应？对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。水的存在往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。有机相中酶反应的优点减少水引起的副反应有利于疏水性底物的反