生物技术制药第三章基因工程制药(1-1)

第三章基因工程制药第一节概述•意义：自20世界70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。•基因工程技术可生产的药物和制剂包括：•（1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；•（2）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；•（3）激素，如胰岛素、生长激素、心素纳；•（4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。•基因工程技术生产药物的优点：•（1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障；•（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的引用范围；•（3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质；•（4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去;•（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。•我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。α1b型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年通过Ⅲ期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。第二节基因工程药物生产的基本过程•定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因再工程菌内进行复制和表达。•基因工程药物制造的一般流程：•（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装。•1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中的（1）、（2）、（3）步骤属于上游阶段，在实验室完成。•2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数大的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述（4）、（5）、（6）、（7）、（8）等属于下游阶段。第三节目的基因的获得•一、逆转录法•逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。•1、mRNA的纯化•mRNA的特点：3’末端含有一多聚腺苷酸组成的末端。•方法：亲和层析法•2、cDNA第一链的合成•一般mRNA都带有3’－polyA，所以可以用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。•用放射性探针法检测。•3、cDNA第二链的合成•以cDNA第一链为模板合成第二链。•4、cDNA克隆•用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。•cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法：•加同聚尾连接：在载体和cDNA的3’末端加上互补的同型多聚酶序列。•人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。•5、将重组体导入宿主细胞•6、cDNA文库的鉴定•7、目的cDNA克隆的分离和鉴定•（1）核酸探针杂交法•（2）免疫反应鉴定法•逆转录－聚合酶反应法。该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。•二、化学合成法•前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。•操作：见书•限制：一、不能合成太长的基因。二、人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难。三、费用高第四节基因表达•基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。•基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。基因表达概念的示意图•一、宿主细胞的选择•宿主细胞应满足的要求：•分类：第一类为原核细胞，如大肠杆菌等；第二类为真核细胞，如酵母等。•1、原核细胞•（1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。•（2）枯草芽孢杆菌•（3）链霉菌•2、真核细胞•（1）酵母：酿酒酵母应用广泛。•（2）丝状真菌•（3）哺乳动物细胞•真核生物和原核生物基因表达过程示意图•二、大肠杆菌中的基因表达•1、载体•表达载体必须具备的条件：•（1）载体能够独立的复制•（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记•（3）具有很强的启动子•（4）具有阻遏子•（5）有很强的终止子•（6）有翻译的起始信号•常用的表达载体：•（1）pBV220系统•（2）pET系统几种常用的大肠杆菌表达载体•2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素•（1）外源基因的拷贝数•（2）外源基因的表达效率•①启动子的强弱•②核糖体结合位点•③SD序列和起始密码子ATG的间距•④密码子组成•（3）表达产物的稳定性•（4）细胞的代谢负荷•（5）工程菌的培养条件•3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式•（1）以融合蛋白的表达形式表达药物基因•由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。•（2）以非融合蛋白的形式表达药物基因•（3）分泌型表达蛋白药物基因•三、酵母中的基因表达•1、载体•（1）载体的复制序列包括YEp类、YRp类、YRp类和YIp类。•（2）克隆载体由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易，所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的。•（3）表达载体包括普通表达载体和精确表达载体。重组酵母表达质粒pPIC9K/VP1的结构示意图•2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素•（1）外源基因的拷贝数•（2）外源基因的表达效率主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。•（3）外源蛋白的糖基化•（4）宿主菌株的影响表达用的酵母宿主菌应具备①菌体生长力强。②菌体内蛋白酶要较弱。③菌株性能稳定。④分泌能力强。•四、动物细胞中的基因表达第五节基因工程菌的稳定性•基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。常用的基因工程菌种，以及带有质粒的菌种第六节基因工程菌生长代谢的特点•对菌体生长的调控主要有两种观点：一种认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率；另一种认为是小分子前体和催化组分等等的限制决定了菌体的最大比生长速率。•一、菌体生长与能量的关系•当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。产生乙酸的机制还不完全清楚，一般认为是由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，使部分乙酰辅酶A通过转化为乙酸来供能。高浓度的乙酸能明显抑制菌体的生长。•分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。•实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。•二、菌体生长与前体供应的关系•由于菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子和合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率。基因表达在各个水平的竞争又是各个基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果。由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主•细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。•“严紧反应”：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，合并称为“魔点”的ppGpp的结果。第七节基因工程菌发酵•基因工程菌的培养过程主要包括：•（1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；•（2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。•一、基因过程菌的培养方式•常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。•1、补料分批培养•将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。第七节基因工程菌发酵•基因工程菌的培养过程主要包括：•（1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；•（2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。•一、基因过程菌的培养方式•常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。•1、补料分批培养•将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。•2、连续培养•将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。•3、透析培养•利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。•4、固定化培养•二、基因工程菌的发酵工艺•基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：（1）生物材料方面（2）生产目的方面•1、培养基的影响•常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。•常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。•另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。培养基及灌注式细胞培养袋•2、接种量的影响•接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。•3、温度的影响•温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。•在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA讲解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表。•温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。•4、溶解氧的影响•溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。•外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。•通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。•5、诱导时机的影响•一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。•6、pH的影响•pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响