生物电化学系统合成甲烷和乙酸

生物电化学系统还原二氧化碳同时合成甲烷和乙酸*蒋永1,3苏敏1,2张尧1,3陶勇1李大平1**(1中国科学院成都生物研究所成都610064)(2四川大学生命科学学院成都610041)（3中国科学院大学北京100049）摘要近年来，采用生物电化学系统还原二氧化碳合成有机物已成为环境微生物学研究热点。本研究构建了具有电活性微生物的生物电化学系统，混合菌群通过电极直接传递或电极电子转化为氢气两种方式获得电子同时产生甲烷和乙酸。在设定阴极电势为-1100mV时，甲烷生成速率为17.3mLh-1L-1,乙酸生成速率为13.9mgh-1L-1,总库伦效率可达94.0%。生物阴极群落构成包括了醋酸杆菌属(Acetobacterium)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)和甲烷微粒菌属(Methanocorpusculum)等功能微生物。该研究表明生物电化学系统中，基于混合菌构建的生物阴极可以将二氧化碳还原为多种有机物，并且其中微生物的电子获得方式也存在多样性。图4表0参33关键词生物电化学系统；生物阴极;二氧化碳；甲烷；乙酸CLCSimultaneouslyproductionofmethaneandacetatefromcarbondioxideinbioelectrochemicalsystems*JIANGYong1,3，SUMin1,2，ZHANGYao1,3，TAOYong1&LIDaping1**（1ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofScience,Chengdu610041,China）(2SchoolofLifeSciences,SichuanUniversity,Chengdu610064,China)(3UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)AbstractInrecentyears,reductionofCO2toorganicswithbioelectricalsystemhasbeenaresearchareaofenvironmentalmicrobiology.Thisstudydescribestheperformanceofbioelectrochemicalsystems(BESs),basedonelectrochemicallyactivemixedculture,capableofreducingCO2toCH4andCH3COOHviaabioticallyproducedH2gasand/ordirectextracellularelectrontransfer.CH4andCH3COOHwereproducedatratesof17.3mLh-1L-1and13.9mgh-1L-1,respectively(atpotentialof-1100mV).Thecurrentcaptureefficiencyreachedto94.0%inbatchpotentiostaticexperiments.MicrobialcharacterizationrevealedthatthemicrobialpopulationswereconsistingofMethanobacteriumpalustre,Methanocorpusculumparvum,andacetogenAcetobacteriumsp.TheseresultssuggestthatmixedcultureinBESsshowtheabilitytoconvertCO2intovariousorganiccmoupandsbyacceptingelectronsindifferentways.KeywordsBioelectrochemicalsystems;Biocathode;Carbondioxide;Methane;Acetate1收稿日期Received:接受日期Accepted:*国家自然科学基金项目(No.31270166，No.51074149)SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31270166，No.51074149)**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:[e-mail])生物电化学系统（Bioelectrochemicalsystems，BESs)是一种能够实现从污水处理过程中回收电能的新型装置[1,2]。近年来，BESs已应用于更多的领域，包括重金属回收[3-6]、硝酸盐还原[7-9]以及卤代烃脱氯[10,11]。它的另一个重要应用就是能源物质，如氢气[12]和甲烷[13]等的生产。其中，利用BESs还原二氧化碳生产能源物质及有机化学品引起了越来越多的科研工作者兴趣[14-21]。该工艺过程不仅可以减少二氧化碳排放，而且还能同时生产高附加值的产品[22]。研究表明，微生物可以直接从电极或以产生的氢气两种方式将二氧化碳分别地转化为甲烷和乙酸。Cheng等[14]研究发现在阴极极化电位低于-700mV(vs.Ag/ACl)时，产甲烷菌可以将二氧化碳还原为甲烷。他们的研究证明，甲烷是由微生物利用电流转化直接生成，而不是通过氢气的还原。另一个基于产甲烷混合菌群的BESs[15]可以在较高的库伦效率（大于80%）下将二氧化碳转化为甲烷。在这一研究中，混合菌群直接从电极以及在电子转化为氢气两种方式获得电子还原二氧化碳合成甲烷。纯菌研究表明,多种产乙酸菌，包括Sporomusasp,Clostridiumljungdahlii,Clostridiumaceticum,和Moorellathermoacetica等均能够消耗电流进行二氧化碳还原。其还原产物主要是乙酸，其次是丁酸以及甲酸[16,17]。该研究中，一个重要而且有趣的发现是，产乙酸菌Acetobacteriumwoodii不能消耗电流。这一现象显示醋酸杆菌属(Acetobacteriumsp)的细菌可能不具备通过与电极的相互作用中直接从电极获得电子的能力。产甲烷菌和产乙酸菌通常共存于一个生态系统中[23,24]。因此，利用混合菌构成的生物阴极可能还原二氧化碳同时产生甲烷和乙酸。本研究在构建了富含产甲烷菌和产乙酸菌的混合菌群的BESs基础上，重点考察了功能微生物在特定阴极极化电位势下的甲烷和乙酸同步生成能力。通过循环伏安扫描法分析了菌群的电化学活性。并对阴极上的细菌和古菌菌群结构以及潜在的反应机理进行了分析，以期探讨系统中富集的产甲烷菌和产乙酸菌获得电子的方式。1材料与方法1.1材料1.1.1实验装置本实验采用之前报道的双室生物电化学系统结构改进而来[25]，双室由阳离子交换膜隔开，阴阳两室体积均为245mL（7.0cm×7.0cm×5.0cm）。阴极电极为碳毡（7.0cm×7.0cm），阳极电极为钛板（5.0cm×4.0cm）,钛丝用来连接各部分。参比电极采用Ag/AgCl电极（218型，上海雷磁，相对于氢标准电极电位为+197mV）。在本文中，除特别说明外，所有电位数据均相对于Ag/AgCl电极。生物电化学系统电流的监测采用电化学工作站（EC550，武汉）。1.1.2菌种来源来自成都市第一污水处理厂的活性污泥1.1.3培养基成分阴阳两室采用相同的培养基(L-1)：K2HPO4·3H2O3.0g,kH2PO411.8g,NaHCO36.0g，NaCl1.0g,NH4Cl1.0g,CaCl20.2g，MgSO4·7H2O0.15g,微量元素溶液10mL[26],微生素溶液10mL[17]。1.2方法1.2.1培养条件为了快速有效地筛选出具有电生物合成活性的功能微生物，本实验采用氢气与电极两种电子供体的环境压力下进行功能菌的筛选。在生物电化学系统阴极室中加入220mL培养基，并接种20mL活性污泥。同时在阳极室中加入240mL相同的培养基。在阴极室中通入二氧化碳与氢气的混合气体进行循环曝气，运行四个周期，每个周期10天。其中氢气的比例逐步下降（CO2:H2=6:4,7:3,8:2,9:1）。同时，设定阴极极化电位为-950mV（vs.Ag/AgCl）做为另一个电子供体来提供电子。每个周期结束后，监测甲烷和乙酸的积累量并置换90%的阴极室液体运行下一周期。在四个周期结束后，置换100%的阴极室液体并继续通入纯二氧化碳进行循环曝气。在这一过程中，检测到氢气和甲烷产生说明功能微生物的筛选成功，阴极生物膜已经形成。在富集了功能微生物后，设定极化电势为-1100mV来测试菌群的产甲烷和产乙酸能力。此后，设定极化电势为-600mV，并运行较长周期（20天），并检测生物电化学系统在较高极化电势下的产物生成情况以期进一步分析系统中发生的反应。同时，设置了非生物的对照实验，其运行和分析条件与实验组相同。1.2.2氢气和甲烷测定采用气相色谱仪分析气相组分中氢气、甲烷含量（Agilent7890AGCsystem:3m碳分子筛填充柱;载气为氩气30mLmin-1;柱温30℃;热导检测器80℃）。1.2.3乙酸的测定采用高效液相色谱仪（Agilent1260infinity）分析液相组分中乙酸含量。UltimateC18色谱柱(4.6X250mm,5Lm),流动相为甲醇:0.01molL-1K2HPO4(3：97)溶液，用磷酸调节pH值至2.0。流速为0.8mLmin-1,进样量20uL,检测波长210nm,柱温35℃。1.2.4循环伏安扫描采用三电极体系，以阳极为对电极，阴极碳毡为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极（0.195V，Vs.SHE，上海雷磁）），扫描范围为-1.0~0.4V，速率为5mV/s。1.2.5扫描电镜分析从阴极碳毡取样后，用4%的戊二醛固定1.0h；用pH为7.4浓度为100mM磷酸缓冲液冲洗三次，每次10min；分别用浓度为40%、70%、90%和100%的乙醇进行脱水，每次10min；最后用异戊酸酯脱水2次，每次10min；经二氧化碳临界点干燥（CPD030CriticalPointDryer）和离子溅射仪喷金（SCD005SputterCoater）后，用扫描电子显微镜（FEIQUANTA200，荷兰）观察、成像。1.3.6PCR-DGGE菌群分析剪取一小块阴极碳毡以收集菌体；用基因组DNA快速提取试剂盒（北京百泰克公司）进行总DNA提取；以总DNA为模板，采用细菌通用引物P341f（CCTACGGGAGGCAGCAG）/P518r（ATTACCGCGGCTGCTGG）进行细菌群落组成分析，采用古菌通用引物109f(ACKGCTCAGTAACACGT)/518R（ATTACCGCGGCTGCTGG）进行古菌群落组成分析；采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离和指纹图谱分析。DGGE凝胶电泳采用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性剂浓度30%-60%，60V电压下60℃电泳15hr；采用QuantityOne软件分析DGGE图谱结果。利用MEGA4软件,以邻接法(Neighbor-Joining,NJ)绘制系统发育树.1.3.6电化学效率计算阴极累积电量（eqi）、累积还原当量(eqp)以及库伦效率的计算参考Villano的方法[15]，并考虑到CH4、H2和CH3COOH的摩尔转化系数分别为8eqmol-1、2eqmol-1和8eqmol-1。2结果与分析2.1功能微生物的产甲烷和乙酸性能从图1A中可以看出，在极化电势为-1100mV时，整个过程中阴极电流约60mA。实验组氢气积累量较少（小于4.3mL）。在如此高的电流下仅积累少量氢气，可能是由于微生物不需要通过氢气来获得电子或是阴极微生物对氢气有极高的利用和转化效率。甲烷和乙酸逐渐积累，经过10小时的反应甲烷达42.4mL，甲烷生成速率为17.3mLh-1L-1。乙酸达34.1mg,乙酸生成速率为13.