生理实验法

2014年试验方法总结一、POD测定方法1.标准曲线的制作标准母液：5%的K2Cr2O71.2ml和纯化的10%Co(NO3)2溶液50ml,混合后加蒸馏水稀7倍，即为每毫升相当于6.75ug四邻甲氧基苯酚标准液。取20ml具塞试管6支，编号，按下表配制四邻甲氧基苯酚系列溶液，混合后以1号管调零，与470nm波长下测定吸光度，以标准母液为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。或用计算器求出吸光度（Y）随标准液浓度（X）变化的线性回归方程。试剂123456标准母液/ml0.001.252.505.007.5010.00蒸馏水/ml10.008.757.505.002.500.00标准系列含量/ug0.008.4016.9033.850.6067.50A4700.0000.0280.0640.1380.2120.292图表标题y=0.0285xR2=0.997200.050.10.150.20.250.30.35024681012Y线性(Y)2.样品测定每个样品准备两支试管，一支测定，一支为空白对照。各加酶液100ul，0.1％愈创木酚40ul,蒸馏水2.6ml,加入0.18%的H2O2330ul(空白管不加，多加330ul蒸馏水)，摇匀，计时，27℃下准确反应10min,加5%偏磷酸70ul终止反应。用标准曲线1号管（及蒸馏水）调零，于分光光度计上确定测定管和空白对照管的A470.0.1％愈创木酚40ul5%偏磷酸70ul0.18%H2O2:取30%H2O23mI，蒸馏水定量至500mL.酶愈创木酚蒸馏水双氧水偏磷酸测定0.1ml0.035ml2.6ml0.33ml0.07ml对照0.1ml0.035ml2.6ml相同体积蒸馏水0.07ml二、SOD测定方法1、磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。B液：0.2M的K2HPO4溶液称取分析纯K2HPO4•3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。或（A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。）2、母液的配制：(1)0.05M磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2)130mMMet(甲硫氨酸)：取1.9399克Met用磷酸缓冲液定容至100ml；(3)750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；(4)100μMEDTA-Na2:取0.0372gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml;(5)20μMFD(核黄素):0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。SOD反应液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：核黄素（FD）：H2O的比例为15：3：3：3：3：2.5，按母液顺序配制。3、SOD的测定：取3支试管，取型号相同的试管（以保证一致性），吸取80微升的酶液，加入12mlSOD反应液，4000Lux照光30分钟，一支作对照（不加酶液，以缓冲液代替，加反应液）；一支作空白（加酶液和SOD反应液）置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm比色。4、结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（ACK—AE）×V提／（W×0.5×ACK×V样）单位：NBT光还原50%为单位SOD比活性（酶单位/mg蛋白）=SOD总活性/蛋白质浓度三、CAT1.磷酸缓冲液50mM的PH为7.8（调零用2.3ml缓冲液），反应时加2.2ml缓冲液(21.25ml0.2mol/LNaH2PO4和228.25ml0.2mol/LNa2HPO4至1000ml)2.H2O2，100mM，0.6ml（30%H2O2溶液5.68ml，稀至1000ml）3.酶液，0.1ml4.对照用PH为7.8的磷酸缓冲液来调零5.测定时用新配的H2O2启动反应6.0-1min每10s的变化进行记录7.用石英比色皿，在紫外分光光度计进行测量公式：CAT（µg-1/min）=（△А240*VT）/（0.1*V1*t*FW）△А240——Aso-（As1+As2）/2Aso——对照管吸光值As1、As2——样品管吸光值0.1——A240每下降0.1为1个酶活单位（U）T——加H2O2到最后一次读数时间（min）VT——粗酶提取液总体积（ml）V1——测定用粗酶液体积（ml）FW——样品鲜重（g）四、MDA【试剂】5%三氯醋酸0.5%硫代巴比妥酸（用5%三氯醋酸溶解定容）【测定】1.在提取液（1ml）中加入5ml0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。2.将试管放入沸水浴中煮沸10min,(试管内溶液中有小气泡时计时)，到时间后立即将试管放入冷水浴中。3.带试管冷却后，3000g离心15min，取上清液量其体积，以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测532nm,600nm和450nm处吸光度。4.MDA(mmol*g-1*FW)=[6.452*(A532-A600)-0.559*A450]*Vt/(Vs*FW)五可溶蛋白含量测定[试剂]1.标准蛋白质溶液称取25mg牛血清蛋白,加蒸馏水溶解并定容至100ml,将溶液稀释2.5倍,即为100ug*ml-1标准液,4℃下保存备用.2.考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入85%（质量浓度）H3PO4100ml,再用蒸馏水定容至1000ml，贮存在棕色瓶中，常温下可放置1个月。【方法步骤】1.制作标准曲线：取6支试管，按下表加入各种试剂。加完试剂后将溶液摇匀，放置2-3min,在595nm波长下测定吸光度（在1h内完成比色）。以牛血清蛋白为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或求回归方程。试剂123456牛血清蛋白标准液/ml00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250/ml555555蛋白质含量020406080100A59500.1560.3120.4360.5740.687图表标题y=0.6876x+0.017R2=0.996700.10.20.30.40.50.60.70.800.20.40.60.811.2y线性(y)2.样品蛋白含量确定取蛋白提取液0.1ml,加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得或按回归方程计算蛋白含量。样品中蛋白含量（mg/gFW）=(C*Vt)/(FW*Vs*1000)C为查标准曲线值（ug）POD0.1MPH6.0磷酸缓冲液的配置：A液219.25+B液30.75定容500mlPOD反应液的配置：0.1MPH6.0磷酸缓冲液50ml于烧杯中，加入愈创木酚（C7H8O2，2-甲氧基酚邻甲氧基酚、甲基儿茶酚）28ul，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219ul混合，保存于冰箱中。POD测定：20ul酶液+3ul反应液，与比色皿中在470nm下每隔1min读数一次。共读3次，以每分钟吸光度变化值（△A470/(mg·FW)表示酶活力的大小结果计算：POD活性（△A470/(min·g·FW)=△A470*V/Va/W