第一章生物遗传

第一章生物遗传第一节遗传的细胞学基础－－染色体主缢痕、着丝点、两臂染色体的四种类型：端部着丝点染色体亚端部着丝点染色体亚中部着丝点染色体中部着丝点染色体次缢痕核仁组织者随体第二节生物遗传的变异一、染色体数目的变异1、整倍体单倍体二倍体多倍体2、非整倍体单体型三体型多体型二、染色体结构的变异1.缺失:一条染色体的断片未能与断裂端相接，造成缺失，即末端缺失。或中间缺失。倒位：一条染色体断片倒转位置后，再接到断端上，形成倒位。3.易位：染色体断裂后，断片离开原来位置，接到另一部位上去。4.重复：一个染色体或染色单体发生断裂，断片脱出后植入到另一同源染色体或姐妹单体中。5.环状染色体：染色体长和短臂两末端处断裂，两端断面相互连接，成为有着丝粒环，伴有无着丝粒断片；如果无着丝粒的断片接合成环，称无着丝粒环。三、基因突变不论真核生物还是原核生物的突变，也不论什么类型的突变，都具有以下共同特征：突变的可重复性突变的多方向性突变的可逆性突变的时间效应基因突变的原因：一般可分为人工诱变和自然突变两类。人工诱变：物理、化学和生物三种因素。物理因素：x射线、γ射线、快中子等电离辐射和紫外线等。化学因素：生物因素：主要是指病毒，如麻疹、风疹、疱疹病毒。黄曲霉毒素等。自然突变是指自然界存在的非人工诱发的一类突变。第三节遗传的分子基础一、核酸的种类和结构三、RNARNA可分为：信使RNA(mRNA)转运RNA（tRNA）核糖体RNA（rRNA）转录：是指以DNA为模板合成RNA的过程。转录的基本过程：以一条DNA链为模板，沿着5′~3′的方向，在RNA聚合酶的作用下，按照碱基互补的原则合成与DNA互补的RNA链转录与DNA的合成有何不同：a.转录只在一条多核苷酸链上进行b.合成RNA的酶主要是RNA聚合酶c.c.RNA聚合酶在合成RNA时不需要引物翻译：是指按照mRNA的密码顺序，将各种氨基酸相互连接起来形成肽链的过程。肽链合成的主要步骤１、氨基酸的活化tRNA与相应的氨基酸分子结合，成为有负载的tRNA，又叫氨酰tRNA.第五节基因与基因调控基因是ＤＮＡ（或ＲＮＡ）分子上可以转录或对转录起调控作用的一段核苷酸序列。以乳糖操纵子为例说明基因的调控操纵子：是1961年Jacob和Monod提出的与代谢途径有关的基因转录的协同调控模型。典型的操纵子包括：结构基因：编码那些在某一特写的生物合成途径中起作用的、其表达被协同调控的酶。调控元件：是调节结构基因转录的一段DNA。调节基因：其产物能够识别调控元件，例如阻遏物，可以结合并调控操纵基因序列。乳糖操纵子：是大肠杆菌利用乳糖作为碳源时基因调控的一个实例。当乳糖存在时，细胞可以利用现在的少量β-半乳糖苷酶将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，以作为细胞的碳源和能源。半乳糖则是能与阻遏物结合的诱导物。第三章基因工程制药第一节概述一、传统方法获得内源性生理活性物质的局限性：材料来源困难生产技术要求高造价太高易发生免疫反应二、基因工程与基因工程制药在基本概念基因工程：将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入别一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿表达出新的性状——重组DNA技术。重组DNA分子大都需要在受体细胞中复制扩增，故基因工程即为基因的无性繁殖，即克隆。供体、载体、受体是基因工程的三大要素。对于受体来说，来自供体的基因又称外源基因。基因工程制药：从供体取出所需的基因（目的基因），在体外对其剪切、拼接，实现遗传物质的重新组合，再转入新的宿主（受体）细胞，使目的基因在宿主细胞内复制和表达，生产出预期的有医疗保健作用的活性蛋白或多肽。三、利用基因工程技术生产药物的好处：1）可以大量获得过去难以获得的活性蛋白和多肽2）可以发现更多的内源性生理活性物质3）可以改造和去除内源性物质作为药物的不足4）可以获得新型化合物，扩大药物来源目前制得的基因工程药物（蛋白和多肽类）主要有：１）免疫性蛋白（各种抗原、单克隆抗体）2）细胞因子（干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子）3）激素（胰岛素、生长激素、心钠素）4）酶类（尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶等）第二节基因工程药物生产的基本过程包括的主要程序：获得目的基因组建重组质粒包装构建基因工程菌成品检定培养工程菌半成品检定产物分离和纯化除菌过滤第三节基因工程工具酶一、基因工程工具酶：基因工程过程中用于对DNA分子进行操作的酶，统称工具酶。限制性内切酶（限制酶）连接酶修饰酶（一）限制性内切酶1.限制与修饰现象一种病毒或噬菌体在一种宿主细胞中生长良好，但在另一种细胞中则可能生长很差，这是因为它的DNA受到后一种宿主的限制，即宿主控制性限制。宿主细胞内有限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA甲基化酶（甲基化酶、修饰酶），他们对DNA产物有相同的识别顺序，但有相反的作用效果。即：限制酶分解DNA，修饰酶修饰本身的DNA。由于限制酶没有、而修饰酶具有种属专一性，当外源DNA进入宿主细胞时，宿主的限制酶会将其降解，而修饰酶则不起作用。由此可见，限制-修饰系统构成了物种遗传稳定性的自我防卫系统。修饰酶有时会误将外源DNA修饰，从而免遭宿主限制酶的降解。因此，一种宿主中的病毒感染另一种宿主时，会有万分之一可在新宿主中生存和繁殖。2.限制酶的命名和分类限制酶都是从原核生物中发现的，根据结构和功能的不同分为：Ⅰ型限制酶：切点不固定。Ⅱ型限制酶：具有可以控制和预测的特异性位点，可产生固定的DNA片段。Ⅲ型限制酶：识别位点并非切割位点。限制酶的命名：1）名称由3个字母组成，第一个字母为产生该种限制酶的细菌属名的第一个大写字母，第二、第三字母为种名的前两个字母。如：Eco表示该限制酶来自大肠杆菌Escherichiacoli.2）第四个字母表示该菌株的类型。如：EcoR表示来自大肠杆菌的R株。3）如果一个菌株有几种限制酶，则分别用罗马数字编号。如：HindⅢ表示从嗜血杆菌（Hacmophilusinfluenzac)d株分离到的第三个限制酶。3.Ⅱ型限制酶的特点1）识别特定的核苷酸序列，一般为4~7个核苷酸，多呈回文结构。如：AGCTTCGA2）识别位点即酶切位点4.限制酶在DNA重组中的主要作用1）限制酶切后的DNA分子才可以连接2）构建新质粒3）建立DNA的限制酶图谱4）构建基因文库5）用于DNA分子杂交、DNA序列分析、DNA的放射性探针、DNA甲基化碱基的识别与切割、基因定位、同源性研究等甲基化酶可通过甲基化作用对限制酶的功割位点进行修饰，使之不被限制酶切割。（二）连接酶可以将两段甚至数段DNA片段连接起来的酶。基因工程最常用的有：T4DNA连接酶：从噬菌体T4感染的E.coli中分离得到。分子量68000道尔顿，单链多肽。能催化两个DNA片段的3′羟基和5′磷酸基之间形成磷酸二酯键。可连接粘性末端，也可连接平齐末端。大肠杆菌DNA连接酶：不能连接平齐末端。T4RNA连接酶：催化单链DNA或RNA的5′磷酸与另一单链DNA或RNA的3′羟基间连接。可使T4DNA连接酶连接双链平齐DNA片段的效率提高20倍。(三)基因工程中的修饰酶1.DNA聚合酶:催化DNA体外合成反应,作用时多需要模板.合成的产物序列与模板互补.常用的有:大肠杆菌聚合酶Ⅰ:具5′→3′DNA聚合酶活性5′→3′和3′→5′外切核酸酶活性T4噬菌体DNA聚合酶：活性与Klenow片段相似，但3′→5′外切酶活性。但比Klenow片段强200倍。T7噬菌体DNA聚合酶：耐高温DNA连接酶：最佳作用温度为75~80℃，广泛用于PCR及DNA测序。2.逆转录酶以RNA为模板，指导三磷酸脱氧核苷酸合成DNA的酶。具有：（1）RNA指导的DNA聚合酶活性（2）DNA指导的DNA聚合酶活性（3）RNase活性，即从5′或3′端连续地降解RNA：DNA杂交双链中的RNA部分，从而免去反转录后的RNA模板用NaCI水解的步骤。其重要用途是以mRNA为模板合成cDNA。3.末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）在二价阳离子存在的情况下，催化一个单核苷酸转移到另一DNA分子的3′末端。其主要作用是加一个互补的同源多聚尾巴到载体或cDNA上，造成便于重组的人工粘性末端。4.碱性磷酸酶能从DNA或RNA的三磷酸核糖核苷酸或三磷酸的脱氧核糖核苷酸上切去5′磷酸根残基。用途：处理DNA或RNA后，在5′端标记32P，以进行序列分析。或去除DNA片段5′磷酸，以防止重组过程中的自身环化。第四节目的基因的获得常用方法：直接分离法逆转录法（酶促合成法）化学合成法构建DNA文库法一、从基因组中分离基因1.密度梯度离心法利用密度梯度高速离心技术使切割开的密度不同的DNA片段分离开，再与放射性标记（或荧光标记）的mRNA杂交检验，分离得到基因。2.单链酶法GC间因有三个氢键，稳定性较AT高，熔解温度（Tm值）亦较高。可以通过控制溶解温度，使DNA富AT区域变性成单链，而GC区仍为双链。用单链核酸酶S1去除单链，可得到富含GC的DNA片段。3.分子杂交法单链DNA与序列互补的DNA或RNA单链结合成双链，即为分子杂交。4.构建DNA文库法又称鸟枪法或散弹法，是基因工程早期分离目的基因普遍采用的方法，特别适用于原核生物的基因分离，对于真核生物使用此法，则可获得真正的天然基因。其大致步骤是：构建基因文库法分离目的基因的基本步骤：1.从供体细胞制备高纯度的基因组DNA；2.用合适的限制酶把DNA切成许多片段；3.DNA片段群体与载体分子体外重组；4.重组体引入受体细胞群体；5.在培养基上生长成重给菌落或噬菌斑；6.设法筛选出含有目的基因的DNA片段克隆。当用上述方法制备的克隆数多到足以包含该生物的全部基因时，这一组克隆DNA片段之集合体，就称为该生物的基因文库。有了基因文库，人们在分离目的基因时，就可以从文库中筛选，而不必重复地进行全部操作。二、逆转录法先分离得到目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。1.mRNA的纯化mRNA的特点:占细胞内RNA总量的2~5%;相对分子质量几百~几千;真核细胞中的mRNA的3′末端常含有20~250个腺苷酸——poly(A)。提取方法1：用酚-氯仿溶液从细胞裂解液中提取总RNA，在高盐缓冲存在的情况下，通过寡聚dT纤维素柱，然后用低盐缓冲液洗脱mRNA。这是提取mRNA的传统方法。提取方法2：将结合有寡聚dT的磁珠加入细胞裂解液中，再用强磁铁将磁珠吸出，然后洗脱mRNA。目前常用此法。提取方法3：用蔗糖梯度来提取mRNA-核糖体复合物。可作为提取mRNA的替换途径。2.cDNA第一链的合成利用mRNA带有3′--poly(A)的特性，以寡聚dT为引物，向反应体系中加入四种dNTP，在逆转录酶的催化下，合成cDNA第一链。这种被称为“自身引导法”合成cDNA第二链的方法，由于切割反应难以控制，易造成cDNA3′端大量丢失，目前已较少使用。现多采用置换合成法。置换合成法的原理：利用cDNA：mRNA杂交体为切口平移反应模板，由RNA酶H在mRNA上造成缺口而产生一系列RNA引物，再由E.coliDNA聚合酶Ⅰ用这些引物以切口平移反应合成cDNA第二链。三、化学合成法将核苷酸单体按3′，5′磷酸二酯键连接成寡聚核苷酸片段。再将寡聚核苷酸片段5′端加磷酸基团，加DNA连接酶连接成完整基因。合成的寡聚核苷酸片段长度应在30~50间，过长合成效率不易控制，短于30个则拼接效率不合理。化学合成法有其局限性：1.合成的基因不能太长。2.要预先知道目的基因的核苷酸顺序。否则，从蛋白质的氨基酸顺序推导出核苷酸顺序，按此合成的基因可能与天然基因不一致。3.费用较高。为什么克隆目的基因要用载体：外源DNA很难进入不同种属的细胞中，即使能单独进入细胞，也不能进行复制增殖。它必须与具有自我复制能力的DNA共价结合后才能被复制。这种具有在细胞内进行自我复制的DNA分子就是外源基因的运载体，或称克隆载体、无性繁殖载体。有了克隆载体，外源DNA不仅能进入受体细胞,而且能