第一节基因工程(一)

基因工程（一）主讲：黄冈中学优秀生物教师严贻兰一、知识概述1、基因工程的诞生及基本原理；2、基因工程的基本工具；3、基因工程的基本操作步骤。二、重点知识归纳及讲解（一）基因工程1、概念：指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。2、其操作水平在DNA分子水上进行设计和施工。3、操作环境是在生物体外。（二）基因工程的基本操作工具1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”来源多数来自原核生物作用切割双链DNA分子特点识别特定的核苷酸序列，并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键结果形成黏性末端或平末端2、DNA连接酶——“分子缝合针”（1）作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（2）DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶作用实质都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键是否需模板不需要需要连接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键作用结果将存在的DNA片段连接成重组DNA分子合成新的DNA分子3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)载体的种类①质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。②λ噬菌体的衍生物。③动、植物病毒。(2)质粒载体的特点①能够在细胞内自我复制。②具有一个或多个限制酶切割位点，便于供外源DNA片段插入其中。③具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(3)基因工程基本工具的比较（三）基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。(2)获取方法：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成。(3)基因文库、基因组文库及部分基因文库①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。②基因文库种类：基因组文库（含有一种生物的全部基因）、部分基因文库（含有一种生物的部分基因如cDNA文库）。（4）PCR技术与DNA复制的比较DNA复制PCR技术区别场所细胞内生物体外酶DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶耐热的DNA聚合酶(Taq酶)温度条件细胞内温和条件在较高温下进行解旋的方式解旋酶催化高温下变性解旋结果形成整个DNA分子短时间内形成大量的DNA片段联系模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板原料：均为四种脱氧核苷酸(即dCTP、dATP、dGTP和dTTP)酶：均需要DNA聚合酶进行催化引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸2、基因表达载体的构建(1)基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。(2)基因表达载体的构建方法3、将目的基因导入受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法(主要)，基因枪法和花粉管通道法显微注射技术，病毒感染法Ca2＋处理细胞法受体细胞受精卵或体细胞受精卵微生物细胞转化过程构建重组质粒→农杆菌→导入植物细胞→整合到植物细胞的DNA上→表达构建重组质粒→显微注射→受精卵→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组质粒与感受态细胞混合→重组质粒进入感受态细胞4、目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法结果分子检第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交(DNA和DNA之间)是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录分子杂交技术(DNA测出信使RNA和RNA之间)第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交方法个体水平检测包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等基因工程图解：抗虫棉的培育过程典型例题例1、下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是（）A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌D．目的基因成功导入的标志是受体细胞能产生出人的生长激素答案：C解析：将目的基因导入到细菌细胞中常用的方法是Ca2＋处理法；基因必须保持结构的完整性才能得以表达，而抗氨苄青霉素基因结构完整，能够表达而使细菌具有对氨苄青霉素的抗性，在含有氨苄青霉素的培养基上能存活的是导入了质粒A或导入了重组质粒的细菌；由于将人的生长激素基因导入到质粒的抗四环素基因上，破坏了抗四环素基因的完整性，导入了重组质粒的细菌也没有对四环素的抗性，在含有四环素的培养基上不能存活，能存活的是导入质粒A的细菌。例2、利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素。下列相关叙述，正确的是（）A．人和大肠杆菌在合成胰岛素时，转录和翻译的场所是相同的B．DNA连接酶能把两个黏性末端经碱基互补配对后留下的缝隙“缝合”C．通过检测，大肠杆菌中没有胰岛素产生则可判断重组质粒未导入受体菌D．在培养大肠杆菌的工程菌过程中，获得目的基因的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA聚合酶答案：B解析：本题主要考查基因工程的基本工具以及基本操作步骤。人是真核生物，转录的场所主要在细胞核，大肠杆菌是原核生物，转录的场所在细胞质，所以A错误；DNA连接酶的作用是在基因工程第二步将目的基因与载体连接成重组DNA分子或形成基因表达载体，它能把两个黏性末端经碱基互补配对后留下的缝隙“缝合”，所以B正确；大肠杆菌中没有胰岛素产生，可能是重组质粒虽然导入受体菌，但目的基因未表达，所以C错误；获得目的基因的工具酶只有限制性核酸内切酶，所以D也错误。例3、请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_______。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。①第1组：______________________；②第2组：_________________。(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为____________。(4)用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1kb即1000个碱基对)，请画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。答案：(1)15/16(2)①引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效②引物I′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上(4)见下图-返回-同步测试一、选择题1、下列关于基因工程的叙述中，正确的是（）A．基因工程经常以抗生素抗性基因为目的基因B．细菌质粒是基因工程常用的运载体C．通常用一种限制酶处理目的基因的DNA，用另一种限制酶处理运载体DNAD．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体2、限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamHI、EcoRI、HindⅢ和BglⅡ的识别序列和切割位点，切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是（）A．BamHⅠ和EcoRⅠB．BamHⅠ和HindⅢC．BamHⅠ和BglⅡD．EcoRⅠ和HindⅢ3、科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶主要蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是（）A．采用反转录的方法得到的目的基因有内含子B．基因非编码区对于目的基因在块茎中的表达是不可缺少的C．马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞D．用同一种限制酶，分别处理质粒和含目的基因的DNA，可产生相同黏性末端而形成重组DNA分子4、下列关于基因工程的叙述，正确的是（）A．目的基因和受体细胞均只能来自微生物B．限制性核酸内切酶和质粒是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达5、基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。根据图示判断下列操作正确的是（）A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割6、在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是（）A．用mRNA为模板逆转录合成DNAB．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成C．将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选D．由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA7、采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是（）A．人体细胞中凝血因子基因的碱基对数目，小于凝血因子氨基酸数目的3倍B．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA分子导入羊的受精卵C．在该转基因羊中，人凝血因子基因只存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中D．人凝血因子基因开始转录时，在DNA连接酶的催化下以DNA分子的一条链为模板合成mRNA8、除了下列哪一项之外，其余的都是基因工程的运载体所必须具备的条件（）A．能在宿主细胞中复制并保存B．具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接C．具有标记基因，便于进行筛选D．是环形状态的DNA分子9、利用含抗四环素基因的质粒将不含有抗四环素基因的大肠杆菌改造成工程菌，生产鼠的β－珠蛋白，相关操作不合理的是（）A．利用反转录技术获得β－珠蛋白基因B．用含抗四环素基因的质粒构建基因表达载体C．用Ca2+处理含有四环素抗性的大肠杆菌使其变成感受态D．用含有四环素的培养基筛选导入重组质粒的工程菌10、下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（）A．①②③④B．①②④③C．①④②③D．①④③②显示提示提示：1、B提示：本题考查基因工程的操作工具和操作程序。基因工程中运载体上的抗生素抗性基因为标记基因；为了获得相同的黏性末端，常用同一种限制酶切割运载体和目的基因；培育转基因植物的受体细胞可以是体细胞，也可以是受精卵。2、C提示：只有黏性末端相同才可互补，BamHⅠ和BglⅡ切出的末端相同。3、A提示：采用反转录的方法得到目的基因的过程是以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的目的基因。由于信使RNA中没有与内含子相对应的部分，所以采用反转录的方法得到的目的基因不存在内含子。基因非编码区对于基因的表达具有调控作用。植物细胞的全能性很容易得到表达，所以转基因植物培育过程中的受体细胞可以是植物的体细胞。限制酶具有专一性，只有用同一种限制酶处理才能获得相同的黏性末端，才能够形成重组DNA分子。4、C提示：基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，质粒是常用的运载体不是酶；人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，只有经过一定的物质激活以后，才有生物活性。载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。所以C正确。5、D提示：本题中要遵循一个原则：不能同时将两个标记基因切开，至少保留一个，所以只能用酶Ⅰ切割质粒；而从目的基因右侧碱基序列可知只能用酶Ⅱ，切割目的基因才能得到含目的基因的DNA片段。6、B提示：在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是以4种脱氧核苷酸为原料，人工合成目的基因；以