第七章病毒学

第七章病毒病毒(virus)：是一类没有细胞结构但有遗传复制等生命特征，主要由核酸和蛋白质组成的大分子生物。是比细菌更小的专性细胞内寄生的微生物，大多数能通过细菌过滤器。一、病毒的发现和研究历史1886年，A.Mayer发现具有传染性的烟草花叶病。1892年，D.Ivanovsky烟草花叶病病原体能通过细菌滤器：他做了这样一个实验：烟草花叶病—→细菌过滤器—→健康烟草植株发病（引起相同烟草花叶病）P、Ivanowski认为这种病原物是一种比细菌还小的微生物，把病毒等其他微生物分开是一个划时代的创举，遗憾的是把这种病原物称为是一种极小的细菌1898年，MWBeijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果：能通过细菌滤器；可被乙醇沉淀而不失去其感染性，能在琼脂凝胶中扩散；用培养细菌的方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活；比细菌小的具有传染性的活的流质（contagiumvivumfluidum），并给以拉丁名(Virus)，被誉为“病毒学之父”。1935年斯旦来（Stanly，USA）第一次提纯得到病毒的结晶，从此以后病毒学进入到分子水平。Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年，Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒；病毒学（virulogy）：研究病毒（virus）的本质及其与宿主的相互作用的科学，是微生物学的重要分支学科。二、病毒的特点和定义特点：1）不具有细胞结构，具有一般化学大分子的特征。2）一种病毒的毒粒内只含有一种核酸，DNA或者RNA。3）大部分病毒没有酶或酶系极不完全，不含催化能量代谢的酶，不能进行独立的代谢作用。4）严格的活细胞内寄生，没有自身的核糖体，没有个体生长，也不进行二均分裂，必须依赖宿主细胞进行自身的核酸复制，形成子代。5）个体微小，在电子显微镜下才能看见。6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。其特点：超显微、没有细胞结构、专性活细胞内寄生的实体。非细胞生物（真）病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分亚病毒类病毒：只含具侵染性的RNA组分卫星病毒：具有核酸基因组，借助于Help病毒卫星RNA：只含有不具侵染性的RNA组分，借助于Help病毒朊病毒：只含蛋白质三、病毒的宿主范围病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性噬菌体（phage）、植物病毒（plantviruses）动物病毒（animalviruses）四、病毒的培养和纯化1、病毒的培养病毒的培养：二元培养物法1)噬菌体→细菌培养物→培养液→细菌培养液变清亮营养琼脂平板→细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬斑（plague）。如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对噬菌体的数目进行估算。2）动物病毒实验动物鸡胚多种细胞培养大多数动物病毒感染敏感细胞培养能引起其显微表现的改变，即产生致细胞病变效应（cytopathiceffect,CPE），例如细胞聚集成团、肿大、圆缩、脱落，细胞融合形成多核细胞，细胞内出现包涵体（inclusionbody），乃至细胞裂解等。若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（plaque）或称空斑。3）植物病毒植物病毒→敏感植物叶片→产生坏死斑，或称枯斑2、病毒的纯化标准病毒是有感染性的生物体→纯化的病毒制备物应保持其感染性病主要化学组成为蛋白质→蛋白质提纯方法（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）毒具有一定的大小、形状和密度差速离心梯度离心（超速离心）第二节毒粒的性质毒粒（病毒颗粒）：病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。即：一团能够自主复制的遗传物质+蛋白质外壳+包膜蛋白质外壳保护遗传物质免遭环境破坏，并作为将遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。一、毒粒的形态结构1、病毒的大小和形状个体小，必需在电镜下观察；不同病毒的毒粒大小差别很大；毒粒的形状大致可分球形颗粒(或称拟球形颗粒)、杆状颗粒和复杂形状颗粒（如蝌蚪状，卵形）等少数几类。2、毒粒的壳体结构壳体或衣壳（capsid）：包围着病毒核酸的蛋白质外壳，由蛋白质亚基按对称的形式、有规律地排列而成，是病毒毒粒的基本结构。螺旋对称壳体壳体结构类型二十面体对称壳体双对称结构3、病毒的包膜结构核壳（nucleocapsid）：病毒的蛋白质壳体和病毒核酸（核心）构成的复合物，又称核衣壳。裸露毒粒（nakedvirion）：仅由核衣壳构成的病毒颗粒：如烟草花叶病毒、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）等一些简单的病毒的毒粒。有些病毒核衣壳包裹着的一层脂蛋白膜，它是病毒以出芽（budding）方式成熟时，由细胞膜衍生而来的。有维系毒粒结构，保护病毒核壳的作用。特别是病毒的包膜糖蛋白，具有多种生物学活性，是启动病毒感染所必需的→有包膜的病毒病毒包膜的基本结构与生物膜相似，是脂双层膜。在包膜形成时，细胞膜蛋白被病毒的包膜糖蛋白取代。刺突（spike）：包膜或核衣壳上的突起。4、毒粒的结构类型裸露的二十面体毒粒；四种主要结构类型裸露的螺旋毒粒；有包膜的二十面体毒粒；有包膜的螺旋毒粒；二、毒粒的化学组成核酸毒粒蛋白质基本化学组成,病毒颗粒在化学上表现为核蛋白（化学组成）脂类碳水化合物1、病毒的核酸核酸是病毒的遗传物质；一种病毒的毒粒只含有一种核酸DNA或是RNA。2、病毒的蛋白质非结构蛋白:病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。结构蛋白:构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质,包括:壳体蛋白；包膜蛋白；存在于毒粒中的酶；第三节病毒的复制病毒的特点：严格细胞内寄生物，只能在活细胞内繁殖。病毒的复制：病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制（replication）。一、病毒的复制周期1、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）1939年，MaxDelbruck&EmoryEllis对噬菌体（E.coli/bacteriopage）生长特征的测定：1)用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞；2)数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）；3)将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞；4)保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量进行计数）；5)以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线；以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，离心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清处理病毒—细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。2、病毒生长曲线分为三个阶段（1）吸附期:游离的噬菌体吸附到宿主细胞。（2）潜伏期:从噬菌体吸附细胞到释放出新噬菌体的最短时期。（3）裂解期:随着菌体不断破裂，新噬菌体数目增加，直到最高值。在潜伏期的前一段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内的数量急剧增加。自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为隐蔽期。不同病毒的隐蔽期长短不同，例如，DNA动物病毒的隐蔽期为5～20小时，RNA动物病毒为2～10小时。隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系，从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式产生。3、细菌病毒的复制周期①吸附：可逆吸附：随机碰撞而接触（静电引力或氢键），无特异性（非细胞颗粒也可吸附）启动病毒感染的第一阶段不可逆吸附：特异性：病毒表面蛋白与细胞受体的结合病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体，病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒的宿主范围。②侵入：侵入又称病毒内化，它是一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同噬菌体：注射方式将噬菌体核酸注入细胞，1）通过尾部刺突固着于细胞；2）尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；3）尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外；动物病毒：①完整病毒穿过细胞膜的移位方式；②细胞的内吞功能；③毒粒包膜与细胞质膜的融合；植物病毒：通过因人为地或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白（movementprotein③脱壳；脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸的过程。脱壳是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件。④病毒大分子的合成，包括病毒基因组的表达与复制；病毒利用宿主的生物合成机构和场所，使病毒核酸表达和复制，产生大量的病毒蛋白质和核酸。病毒基因组的表达与复制存在着强烈的时序性⑤装配与释放：新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒，称做病毒的装配，亦称成熟（maturation）或形态发生（morphogenesis）。成熟的子代病毒颗粒然后依一定途径释放到细胞外病毒的释放标志病毒复制周期结束.第四节病毒的非增殖性感染增殖性感染（productiveinfection）：感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并以有感染性病毒子代产生为特征。非增殖性感染（non-productiveinfection）：病毒进入敏感细胞后的某一阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然亦可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。病毒的非增殖性感染：流产感染（abortiveinfection）；限制性感染（restrictiveinfection）；潜伏感染（latentinfection）一、缺损病毒1.干扰缺损颗粒(defectiveinterferingparticles,DI)基因组有缺损，不能完成复制循环，必须依赖于完全病毒才能复制。2.卫星病毒(Satelliteviruses)寄生于与之无关的辅助病毒的基因产物的病毒.基因组缺损,必须依赖于辅助病毒才能复制,但它的形态结构和抗原性都与辅助病毒不同,两者的基因组也很少有同源性,是自然界中存在的一种绝对缺损病毒.如腺联病毒,含有DNA单链的二十面体结构.3.条件缺损病毒基因组发生了突变的病毒条件突变体,在允许条件下,能够繁殖,在非允许条件或限制条件下导致流产感染.4.整合的病毒基因组烈性噬菌体（virulentphage）：感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环（lyticcycle）。温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenicphage）：感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。这一现象称做溶源性（lysogeny）现象。在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如λ噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。整合到细菌染色体或以质粒形式存在的温和噬菌体基因组称作前（原）噬菌体(Prophage)。在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解，进入裂解循环。细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做溶源性细菌（lysogenicbacteria）溶源性感染