第七组液相色谱-核磁共振联用技术在药物分析中的应用

药物分析课程论文综述液相色谱-核磁共振联用技术在药物分析中的应用药学2011级（2）班刘星明（1103501226）张婷（1103501227）林敏燕（1103501228）刘培能（1103501229）指导教师：周漩2014年6月摘要液相色谱（LC）是分离各种未知混合物的高效能的物理分离技术，核磁共（NMR）是结构分析的强有力手段。液相色谱–核磁共振（LC-NMR）联用技术能达到快速分离、结构鉴定并且定量分析的目的，该技术在药物分析中的应用非常广泛，具有广阔的应用前景。本文主要对LC-NMR联用技术在化学药物分析（包括未知杂质的结构分析、混合物中已知成分的定量分析）、中药物分析（包括异构体分析、新化合物的结构鉴定），天然产物，代谢产物分析中的应用进行详细的综述。关键词：生物碱；中药材；含量测定前言液相色谱-核磁共振谱联用技术(LC-NMR)的尝试始于20世纪70年代末,但直到90年代中后期才发展得较为成熟并且得到推广使用。而随后从确定菊科植物Zaluzaniagrayana的粗提物中倍半萜内酯成分的结构开始,LC-NMR在天然产物分析中逐渐显示出高效、快速、微量的优势。现由于LC-NMR一体化联用技术能一次性完成从样品的分离纯化到峰的检测、结构测定和定量分析,提供大量分子结构和混合物组成的信息,提高了研究效率和灵活性,因此引起人们的广泛关注,现已成为目前用于天然产物研究的一种新型分析手段,。随着对药品分析要求的提高，LC-NMR又与质谱（MS）等技术联合，发展成了LC-SPE-NMR联用、LC-MS-NMR联用，实现优势互补,在混合物成分的结构鉴定中具有不可替代的作用。LC-NMR联用技术包括连续流动（on-line）和停止流动（off-line）两种模式。LC-NMR在混合物尤其是未知物的结构鉴定中的应用已经越来越广泛。在药物分析的领域：有机小分子药物的鉴别、定量，生物大分子类生化药物的结构研究；对药物的体外评价与研究、对体内药物的监控与研究等也有广泛使用。本文主要阐述本文综述LC-NMR联用技术在分析化学药、中药药物分析，天然产物分析，代谢产物分析的应用。1化学药物分析1.1未知杂质的结构分析LC-NMR联用技术在分析未知杂质时，无需纯品做对照，不产生破坏性，具有专属性强、快速、准确、精密度好等优点。为混合物的即时分离、鉴定提供了一种简便、快速、准确的方法。检测药物中的杂质是这一技术应用领域之一。杨春[1]等用高效液相色谱-核磁共振(HPLC-CNM)联用技术中的连续流动和停止流动两种模式对萘哌地尔中杂质进行检测。所有的高效液相色谱采用Varian公司的Prostar-230高效液相色谱仪,分析柱为InertsilODS-3柱(4.6I.D.
250mm,5
m)，萘哌地尔样品用乙腈溶解,浓度为5g/L。连续流动的进样量为20
L,停止流动的进样量为50
L。检测器为VarianProstar-330二极管阵列检测器,紫外检测波长为210nm。HPLC分离条件为乙腈
磷酸缓冲溶液=65
35(pH7.8~8.0)。所有的图谱均在INOVA-500核磁共振仪上完成。HPLC-NMR采用反相60
L流动探头。WET脉冲序列抑制乙腈和重水的溶剂峰,同时抑制乙腈的卫星峰。在没有纯品的对照下，根据1HNMR,1H-1HCOSY谱完成了主要杂质1-萘环-丙三醇结构鉴定。联用技术同时能得到化合物的UV、NMR、MS信息，为化合物分析提供了全面的信息。孙煌[2]等应用HPLC-MS/MS/核磁共振(1H-NMR/13C-NMR/HMBC)技术，对多索茶碱及其未知杂质进行结构分析,首次发现并确定多索茶碱未知杂质的结构。采用InertsilODS-3（4.6μm,2.1mm×150mm,迪马公司），流动相为乙腈-水(82:18)，进样量为10μl，通过ESI与LC相联采用全扫描一级质谱及全扫描二级质谱同时测定。通过多索茶碱对照品及茶碱对照品确定未知杂质，通过其产物离子推测，该未知杂质为多索茶碱的同分异构体1,3-二甲基-9-（1,3-二氧环戊基-2-基）甲基-3,9-二氢-1H-嘌呤-2，6-二酮。采用联用技术已经证明是一种有效的研究工具，特别是在药物研发、生产过程中。1.2混合物的定量分析核磁共振波谱用于定量分析的基础是不同化学环境上的原子核共振吸收峰面积只与它的原子数有关，因此，不需要引进任何校正因子，不需要为每一种被测物选择相应的标准品。LC-NMR广泛应用于有机化合物的定性分析，它在化合物纯度定值含量测定中也具有很多优势，现已经广泛应用于药物合成及生产中。《美国药典》规定使用定量NMR法，以苯甲酸苄酯为内标物，进行亚硝酸戊酯的定量分析。此外，LC-NMR法还应用于多种药物的副产物或降解产物含量测定，具有快速、简便、专属性高的特点；与其他方法相比，有不破坏样品，信号峰不会发生重叠等优势[3]。柳娜[4]等采用HPLC-PDA和核磁共振(NMR)法定性定量分析。流动相为氘代甲醇–水-乙酸（40|：60：0.5），以1.0mL/min的体积流量在Pure2811C18色谱柱（250mm×8mm，20~40μm）中分离样品，柱温室温，检测波长254nm。BrukerDRX-500NMR仪。杜仲中环烯醚萜类化合物京尼平甙酸(GPA)和京尼平甙(GPS)的质量分数分别为w(GPA)=94.
69%和w(GPS)=93.
27%，该方法能够满足一般的混合物的定量分析，且成本低。Lienau[5]等用LC-NMR联用技术同时分离并定量分析了生育酚这一大类物质。HP1100型HPLC系统，流动相为氘代甲醇–甲醇（5∶95），以0.4mL/min的体积流量在BischoffC30色谱柱（250mm×4.6mm，3μm）中分离样品，柱温22℃，检测波长280nm。BrukerAMX600NMR仪。BrukerEsquire-LC离子阱LC/MS(n)系统，装有大气压化学电离（APCI）源和离子阱。生育酚中各单一成分的量为：α-生育酚醋酸酯96.7%、α-生育酚1.8%、β-生育酚0.7%、γ-生育酚0.1%、δ-生育酚0.1%，检测对样品需求量少，对微量样品也适用。2中药药物分析中药和天然药物成分十分复杂，而有效物质通常多为数种，因此单纯采用一种色谱分离模式通常不能够全面地解决问题，往往需要将多种分离模式相结合。采用LC-NMR可以很好的表征化学成分特征和相对含量的差异。LC-NMR技术在色谱峰分离不完全情况下仍可提供详尽信息，使得同分异构体无需分离提取，便可进行检测分析，大大提高了分析速度。2.1药用成分异构体分析Bobzin等用Hewlett-Packard1100HPLC系统，AlltechAlltimaC18色谱柱，流动相为A0.01%TFA的D2O，B0.01%TFA的10%～100%乙腈，梯度洗脱，体积流量1mL/min，VarianUnity-Inova500MHzNMR仪，有效体积60μL的1H/13CPFG探头，WET脉冲来抑制溶剂峰，连续模式下，联合使用Perkin-ElmerSciexAP100型MS仪对天然产物氨基转移酶中存在的几何异构体进行了鉴定，分别是阿普他明、反式阿普他明、阿普他昔及其类似物。根据质子的偶合常数确定其双键的构型，作者提出虽然LC-NMR联用缺乏灵敏性，但该方法仍然广泛用于已知化合物的分析和未知化合物的结构鉴定，将为药物的研究提供可靠地手段和提高效率。刘宁等用LC-10ATHPLC仪，HPCHEM型LC/MS仪，色谱柱为KromasilC18（250mm×4.6mm，5μm），流动相–水（80∶20），体积流量为1.0mL/min，检测波长216nm。INOV—500MHzNMR仪，在500MHz的工作频率下，以氘代甲醇为溶剂并作化学位移内标，试验在室温下进行，对HPLC分离得到的两种异构体进行NMR分析，得到了双氢青篙素β型差向异构体向α转化过程。实验中得到α异构体和β异构体的δ值分别为5.425.55。从NMR图中可看到共振峰化学位移变化的过程，也说明双氢青篙素的异构体转化现象的存在。王映红等在HPLC-MS分析的基础上用HPLC-NMR技术进一步分析了土茯苓中的二氢黄酮醇苷4个异构体。YMC-PackODS-A（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，柱温25℃，流动相为乙腈（A）、0.05%甲酸的D2O溶液（B），梯度洗脱0～10min5%～20%A、10～45min20%～55%A、45～55min55%～90%A，体积流量0.8mL/min。VarianNOVA-500HPLC-NMR联用系统，停流模式，WET抑制溶剂峰。Agilent1100LC-MSD-TRAPXCTPLUS系统，ESI接口。土茯苓中二氢黄酮醇苷的4个异构体分别为落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷和新异落新妇苷。该方法避免了传统的分离单体成分再鉴定结构的繁琐过程，从而可以简便快速的得各化合物的分子结构信息。Strohschein等研究了β-胡萝卜素的顺/反异构体，分离出5种顺/反异构体，并通过2DNMR确定了3种顺/反异构体结构。用MerckL—6200ALC仪，（250mm×4.6mm，5μm和3μm）硅胶C30色谱柱，分别采用丙酮–氘水（92∶8，93∶7）作为流动相，体积流量为1mL/min。BrukerAMX600NMR仪，BPSU接口，停流模式。其中在3μm硅胶柱分离异构体最大峰比在5μm硅胶柱大。这是由于3μm硅胶柱能分离到异构体更小的洗脱体积，在实验中NMR流通池为120μL，这比洗脱体积小。因此认为NMR检测量取决于样品最大峰的浓度而不是样品的总量。Dachtler等用HPLC-MS和HPLC-NMR在线联合技术进行菠菜和视网膜中的叶黄素和玉米黄质立体异构体的分离和测定，浓度在纳克水平。HP1100HPLC系统，ProntoSILC30（250mm×4.6mm，3μm）色谱柱，柱温为22℃。用氘水作为流动相以减少溶剂峰，流动相为丙酮（A）和水（B），梯度洗脱0～21min86%A、21～25min86%～97%A、25～40min97%A，体积流量为1mL/min。Esquire-LC离子阱MS系统，APCI接口。NMR采用BrukerAMX600NMR仪，BPSU接口，停流模式和连续流动模式结合。结果提示LC-NMR联用技术是结构明确的异构体分析的首选方法，可以用于痕量样品的分析和鉴定。2.2新化合物的结构鉴定Hendrawati等对峨参Anthriscussylvestris(L.)Hoffm.中木脂素类成分的分离鉴定。采用Agilent1200色谱仪，AgilentZorbaxEclipseXDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）色谱柱，柱温为30℃，流动相组分为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸的乙腈溶液（B），0～5min32%B、5～15min32%～86%B、15～15.1min95%B、15.1～20min95%B梯度洗脱，体积流量1mL/min。API3000型MS仪，APCI接口。BrukerAvanceIII500MHz仪和5-mmCPTCI低温探头。获得了1D1H、1H-1H-DQF-COSY、1H-1H-TOCSY、1H-13C-HSQC、1H-13C-HMQC和1H-1H-NOESY谱，最终鉴定了提取物中14种化合物，其中有6种含甲基的木脂素是以前没有报道过的，分别为α-盾叶鬼臼素、β-盾叶鬼臼素、异鬼臼苦酮、去氧鬼臼毒素、换臼毒酮、β-盾叶鬼臼素甲基醚。结果证明联合使用LC-ESI-MS，LC-SPE-NMR技术是一种有效的分离鉴定化合物的分析手段，样品可以通过SPE在线富集，使得NMR灵敏度提高。Zehl等采用Varian9012HPLC系统，色谱柱为HypersilBDS-C18（250mm×4.6mm，5μm），柱温25℃，流动相为0.05%TFA的氘水溶液（A）、乙腈（B），梯度洗脱0～1min12%B、1～20min12%～20%B、20～50m