第三章主要生防微生物类群

1第三章主要生防微生物类群（生防细菌、放线菌、真菌）一、生防细菌Maarten等(1997)报道常见的对植物病害有生防作用的细菌多集中在以下几个属：假单胞杆菌属(Pseudomonas)包括荧光假单胞菌，土壤杆菌属(Agrobacterium)，欧文氏杆菌属(Erwinia)，伯克氏杆菌属(Burkholderia)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。（一）荧光假单胞菌荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）属于假单胞杆菌属，是植物根际有益微生物中种群数量最大的一类革兰氏阴性菌，其营养需要相对简单、能够利用根分泌物中大部分营养迅速在植物根基定殖。同时因其中一些菌株具有促生和生防作用，使其成为最具有应用前景的植物根围促生细菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteriaPGPR)之一。近来年，国内外利用荧光假单胞菌防治土传病害的研究和应用都取得很大的进展(表1)。表1目前在美国上市的荧光性假单胞菌类PGPRTable1-1PseudomonasproductsfordiseasecontrolinUSAmarketPGPR产品名防治对象应用作物制造/销售厂家荧光假单胞菌BlightBanA506霜冻、解淀粉欧文氏菌杏、苹果、蓝莓、樱桃、桃、李、马铃薯、草莓、番茄PlantHealthTechnologies荧光假单胞菌ConquerPseudomonastolassii蘑菇MauriFood荧光假单胞菌菌株NCIB2089VictusPseudomonastolassii蘑菇Sylvan丁香假单胞菌ESC-10Bio-save100Bio-save-1000BotrytiscinereaPenicilliumspp.,Mucorpyroformis,Geotrchumcandidum果类（Bio-save100）柑桔（Bio-save100）SpawnLaboratoryEcoScienceCorp.丁香假单胞菌ESC-11Bio-save110同上梨果类EcoScienceCorp.1荧光假单胞菌的生防机制荧光假单胞菌作为PGPR与植物间的相互作用十分复杂。研究表明其促进植物生长多数是以病原菌存在为前提，抑制病原菌对植物根系的危害，间接促进植物的生长。生防荧光假单胞菌的作用机理多种多样，就目前已经肯定的机理，包括抗生作用、营养和位点竞争、诱导抗病性等等。（1）营养和位点竞争不同的作物根际为微生物提供的可利用营养不同。有益微生物和病原菌之间竞争有限的营养物质必然会影响病原物的生长和致病性。Daniel等（1991）获得了荧光假单胞菌的突变株M114，它是蛋白酶缺失突变体，不能利用葡萄糖、海藻糖、葡糖酸、果糖，甘露醇和甘油，而且对琥珀酸，苹果酸和延胡索酸的利用方面有缺陷。突变体M114和野生型菌比较，在甜菜根际定殖能力无显著的2差别。但与野生菌株相比，M114在甜菜的根际能够充分地利用各种不同的碳源营养。作物根际含有大量以植物和微生物不能利用的形式存在的铁元素。在根际土壤中，Fe(OH)3的溶解度非常低，有效铁Fe3+的浓度仅有10-17mol/L，远远不能满足微生物正常的生长需要(10-5-10-7mol/L)。因此，在微酸性、中性和碱性土壤中，有效铁Fe3+浓度都满足不了微生物正常生长需要的有效铁含量。大多数的微生物都能产生一种低分子量的、与Fe3+具有很高亲和力的物质，称为嗜铁素（Siderophore）。Klopper等（1980）首次发现和证明了荧光假单胞产生的嗜铁素作为一种作用机制在生物防治中具有重要作用。其将荧光假单胞菌野生菌株与化学诱变获得的不产嗜铁素的突变菌株分别与病原物接种在Fe3+贫乏的培养基中，发现野生菌株显著抑制病原菌的生长，而突变菌株对病原菌没有抑制作用。向缺铁介质中补加嗜铁素后，突变菌株则恢复了对病原菌的抑制作用。以上结论说明在铁胁迫条件下，荧光假单胞菌通过产生嗜铁素，在与病原物竞争铁营养的过程中占有优势，从而抑制了病原物的生长。此后许多研究表明在荧光菌对根际有害微生物，如小麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.tritici）、镰刀菌枯萎病菌（Fusariumoxysporiumspp.）和腐霉根腐病菌（Pythiumspp.）的生物防治中产生的嗜铁素都有抑制病原菌的作用。进一步研究表明，植物根际的荧光假单胞菌产生的嗜铁素与三价铁离子形成复合体，可被荧光菌和植物利用，而病原菌则不能利用，因此其不能获得生长需要的铁离子，种群数量减少，致病力降低，而间接的保护了植物健康的生长。根际生态位点的竞争是生物防治土传病害的另一个作用机制。大量研究证实，防病效果好的生防细菌，大多具有定殖能力强，能够分布于根的各个区域的特性。通过种子处理，假单胞菌极易定殖在植物根际，占领根际有效位点，对土传病害的防治效果明显好于将有益菌接种在土壤中。用不产生冰核的突变菌株（Ice-mutantofPseudomonassyringae）与产生冰核的菌株同时接种植物预防霜冻。试验结果表明：由于植物叶面的生态位点有限，非致病突变体的定殖减少了致病群体的定殖，霜冻害有明显减轻。（2）诱导抗性诱导抗病性（inducedresistance）是指利用物理、化学和生物方法，预先处理植物，诱导植物启动自身的防御机制，增强对后续病原物的抵抗能力。荧光假单胞菌的一些菌株能通过诱导植物产生对病原物的抗性，或通过产生某些物质诱导植物产生抗性。vanPeer等（1991）用P.fluorescensWCS417r和病原菌F.oxysporumdianthi分别接种康乃馨（前者接种在根部，后者接种在茎部），WCS417r处理根部比茎部早接种病原物提前一个小时，枯萎病发病率从50%下降到20%，试验中WCS417r并未接触到病原物，其对枯萎病菌的防治不是通过二者之间的竞争和拮抗作用，而是诱导了寄主植物的抗病性。同时，用恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌的一些菌株处理青豆，黄瓜种子后，发现幼苗茎，叶上的病害症状都明显减轻，但在茎、叶部位并未分离到原接种的菌株。某些荧光假单胞菌产生HCN也能诱导植物产生抗性，Voisard等人发现野生型P.fluorescensCHA0的HCN-突变株失去了抑制烟草黑根腐病的能力。在烟草上已经确认HCN有诱导抗病的能力。用棉花枯萎病菌的无毒菌株或弱致病性菌株进行预先接种，24小时内即可表现交叉保3护效果，接种无毒菌株的同时诱导了对维管束的堵塞和类萜的合成，堵塞作用造成棉花植株组织中病原菌数量的减少。目前，对植物根际有益菌诱导抗病性的研究结果表明：诱导抗病性的根际细菌在不同植物根际的定殖没有专化型，而产生诱导抗病性则对植物存在较高的专化型。恶臭假单胞菌WCS358r和WCS374r诱导抗病性的植物种类明显不同，WCS358r能够诱导拟南芥的抗病性，但对萝卜、康乃馨无诱导作用。根际有益菌诱导抗病性与病原菌诱导抗病性的机制明显不同。根际有益菌产生的脂多糖、嗜铁素和鞭毛蛋白是诱导抗性的决定因子。（3）抗生作用－产生抗生素抗生素是由微生物产生的具有生物学活性的物质，它在很低浓度下就能抑制或影响其它生物的机能，从而对敏感微生物产生抑制或致死作用。大约在一百年前，欧洲科学家就发现了微生物间的拮抗作用。自从1877年，巴斯德发现一种细菌抑制另一种细菌的拮抗现象后，世界各国对利用微生物防治植物病害的研究发生了浓厚的兴趣。由于生防菌产生的抗菌素具备抑制病原菌微生物生长的能力，因此生防菌的拮抗作用在目前植病生防菌筛选中是最重要指标，产生抗生素与否及其产量大小往往决定着一个生防菌株的命运。在防治植物病害中起着重要作用的荧光假单胞菌在其生长环境中能分泌多种胞外活性物质，具有拮抗专化性，可以抑制不同种属的真菌和细菌，已在实际应用中取得了可喜的进展。假单胞杆菌属和伯克氏杆菌属在人工培养条件下产抗生素能力最强。生防假单胞杆菌能够产生一到多种抗生素，例如：2,4-二乙酰基藤黄酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG)，吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid,PCA)，藤黄绿脓素(pyoluteorin)，硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)和氰化物(HCN)，对疫霉菌、青枯病菌等均有一定的抗生活性[4]。在近二十年中，由于分子生物学手段应用于生防机制的研究，使微生物之间的拮抗作用成为生防机理研究中最清楚的部分。假单胞杆菌Hv37a产卵菌素(oomycin)A能力缺陷的突变株与野生菌株相比，防治棉花猝倒病的能力降低50%。同样，HCN、2,4-DAPG、吩嗪、硝吡咯以及荧光假单胞菌产生的吩嗪-1-羧酸可体外抑制小麦全蚀病菌Gaeumannomycesgraminisvar.tritici的生长。Thomshow等（2002）研究还表明基因直接参与抗生素的产生，通过采用高压液相色谱分析表明，在吩嗪产生菌定殖的小麦根部检测到了吩嗪，而在吩嗪合成基因缺失的突变体定殖的小麦根围没有检测到吩嗪，以上结论为荧光假单胞菌产生抗生素和它直接参与病害的防治提供了证据。为了说明假单胞杆菌产生的pyrrolnitrin在防治猝倒病中的作用，Homma等(1994)将纯化的pyrrolnitrin施于种子表面，研究抗生素对病原及病害的抑制情况，结果发现抗生素能够降低病害发生率30～50%，这与使用菌剂包衣的防病效果相当。进一步为抗生素在生防菌防治病害中的重要性提供了直接的证据。Shanahan等人从一株荧光假单胞菌中提纯出2,4-DPAG，这种物质能保护甜菜免遭Pythiuim的侵染，Tn5突变的不产DAPG的突变体失去了抑制Pythiuim的能力。Keel等从另外一株荧光假单胞菌也分离到2,4-DPAG，它能抑制烟草黑根腐病和小麦全蚀病。Raajmakers等（1999）采用HPLC和透射电镜分析和观察了荧光假单胞菌在土壤中产生抗生素2，4-DPAG在抑制小麦全蚀病菌中的作用，结果证明2,4-DPAG是荧光菌防治全蚀病的关键因素。2影响根际定殖的因子4决定假单胞菌在寄主根际定殖能力的相关因子的研究报道并不多，这与根际的复杂程度和接种的生防细菌在根际的不稳定性相关。有研究结果表明，根分泌物中的多糖组分、根表的植物凝集素在定殖中起一定的作用。大豆根部分泌的凝集素对假单胞菌有一定的专一性，其参与细菌对根分泌物较多的位置表现凝集作用的趋性。生防作用、应用方法，定殖影响因素（二）芽孢杆菌芽孢杆菌属(Bacillus)是一类好氧和兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。由于能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性的芽孢,可忍受各种不良环境,如可以在pH为2～3的地方生存,也可以在温度高达80℃甚至以上的地方生长,南极寒冷的冰雪中也能见到他们的踪迹,在自然界分布较为广泛。芽孢杆菌属与人类关系极为密切,是越来越引起人们重视和研究的一个重要的微生物类群。芽孢杆菌属的一个重要特征是好氧生长。能够产生芽孢是芽孢杆菌定属的首要特征。1芽孢杆菌的应用生物肥料巨大芽孢杆菌等可降解土壤中难溶的含磷化合物,使之成为作物易吸收的可溶形态40、50年代,前苏联P.A蒙金娜就曾经使用过以巨大芽孢杆菌为主的混合菌制剂来分解土壤中的有机磷化合物,并取得一定效果。。自1958年Hino首次从日本土壤中分离到一株具有高固氮活性的芽孢杆菌固氮菌株后,土壤中新发现的芽孢杆菌固氮菌株越来越多,国际上承认的固氮能力较高的需氧芽孢杆菌为多粘芽孢杆菌的一个变种(亦称为固氮芽孢杆菌Bacillusazotofixans)。此外,也有一些巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌的部分菌株有一定固氮能力的报道生物农药苏芸金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)最早在1905年日本死于猝倒病的家蚕体内发现,并于1938年在法国首次成为商品。苏芸金芽孢杆菌制剂已成为世界上产量最大的微生物杀虫剂。国内外有许多关于枯草芽孢杆菌对植物病原真菌的抑制作用及防治实验的报道。2枯草芽孢杆菌的应用枯草芽孢杆