牛奶中雌激素残留检测方法研究进展

牛奶中雌激素残留检测方法研究进展摘要：雌激素作为一种类固醇激素，因其对动物及人类内分泌系统的潜在危害已经引起了越来越多的关注。牛奶在人类日常饮食结构中占有重要位置，而研究表明在如今的商业牛奶中雌激素含量呈持续上升趋势。本文阐述了牛奶中雌激素的来源与危害，并重点介绍了对其残留纯化及检测方法的研究进展。关键词：牛奶；雌激素残留；检测ResearchProgressofDetectionMethodsonEstrogenResidualinMilkAbstract:Inrecentlyyears,estrogen,asteroidhormone,hasintensivelybeeninvestigatedduetoitsfunctionalitiesofhumanandanimalendocrinesystemdisordersandcarcinogenicelements.Moreimportantly,milkoccupiesamomentouspositioninpeopledietstructure,whilesomeresearchesdemonstratethereisanescalatingtendencyoncontentofestrogenincommercialmilknowadays.Inthispaper,thesourceandharmofestrogensinmilkispresent,andthecurrentresearchofpurificationanddetectionmethodsonestrogenresidualinmilkissummarizedindetail.Keywords:milk;estrogenresidual;detection雌激素是一类可直接影响动物代谢与繁殖，具有相似化学结构的类固醇激素。该类物质进入机体后，可干扰体内正常分泌物的合成、释放、运转、代谢及结合，激活或抑制内分泌系统功能，最终造成机体代谢调控紊乱[1]。雌激素在自然界中分布广，危害大，即使在极低浓度下也会对生物产生很大的影响。近年来，为促进动物生长而使用雌激素，导致蛋类、肉类和乳类的雌激素残留问题日益严重。己烯雌酚等合成类雌激素虽然早在2002年就已被我国农业部列为禁止使用的药物，并规定食品中不得检出，但在《食品安全国家标准乳粉（GB19644-2010）》中，关于乳粉中雌激素的检测并没有提出要求[2]。与此同时，国际上已公认，残留在食品内的雌激素极有可能增加人类睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌以及子宫内膜癌的发病率[3-6]，鉴于此西方各国纷纷制定相应标准，其中以欧盟最为严格，明确对其禁止使用。人类摄入雌激素的途径很多，其中乳制品是主要来源[7]，因此，为保障饮用牛奶的健康与安全，对其进行相应检测十分必要，随着雌激素残留问题日益受到重视，各种针对牛奶中雌激素含量的检测技术也迅速发展。1牛奶中雌激素的来源与危害1.1雌激素的分类雌激素按来源可分为内源性雌激素和环境雌激素两大类。内源性雌激素在通常情况下主要由卵巢合成分泌，包括雌二醇、雌酮和雌三醇等，其中以雌二醇的活性最高；环境雌激素主要是指人工合成的，具有模拟雌激素作用的化合物，一般被作为药物使用，常见的有双烯雌酚、己烯雌酚、乙炔雌醇、炔雌醚等[8]。除此之外，环境雌激素还包括自然界中存在的真菌性雌激素和植物性雌激素。1.2牛奶中雌激素的来源如今商业牛奶中所含的雌激素既有内源性雌激素，即奶牛内分泌产生的雌激素；也有人工合成雌激素，即应用于奶牛的雌激素[2]。牛奶中内源性雌激素的浓度主要取决于产奶动物的种类，年龄和生理状态等[9]。牛奶本身即含有种类丰富的类固醇，如雌二醇就可在奶牛乳腺中生物合成[10]。时下牛奶早已成为人们日常膳食中的重要组成部分，无论国内外牛奶的生产消费都保持着猛烈地增长势头，但需认识到现在的商业牛奶与过去早已不同，就奶牛品种和饲养方法而言，现代饲养的高产奶牛多经基因改良，其分泌牛奶中的雌激素含量较之过去显著提高；而且为增加牛奶产量，通常使用高蛋白饲料喂养母牛，这也可能导致牛奶中雌激素含量的提高[11]；由于人工授精技术的介入，现代奶牛几乎可以在整个孕期持续泌乳，其血液中的雌激素含量在妊娠后期增加尤为显著[5]。人工合成雌激素是牛奶中雌激素的重要来源。与天然雌激素相比，合成雌激素更为稳定，易在动物组织内残留，进而通过食物链危害人类健康，早在上世纪六十年代，人工合成雌激素因对畜禽动物生长催肥作用明显，就被多国作为促生长剂广泛用于畜牧业，如己烯雌酚，双烯雌酚[12]。以双烯雌酚为例，作为非营养饲料添加剂使用可显著提高动物体重和饲料利用率；亦可诱导乳腺发育的改变，继而调控泌乳，提高奶牛的产奶量；还可作为兽药，治疗禽畜代谢紊乱等[13]。1.3牛奶中雌激素的危害食物链并非雌激素进入人体的唯一途径，直接接触也是重要渠道之一。雌激素通过模拟或拮抗正常的内源性激素，干扰内分泌功能，进而对生殖系统、神经系统和免疫系统等产生多方面影响，大量研究表明雌激素可刺激细胞分化，并与人体癌症的发生存在因果关系[14,15]。AkioSato等[7]研究发现，现在消费的牛奶雌激素含量较高，而这可能与女性乳腺癌，卵巢癌和子宫内膜癌的产生有关。米兰，意大利一项病例对照研究指出，牛奶饮用量与患前列腺癌之间有强烈关联，其让步比（OR）为5.1，与不饮用牛奶的人相比，每天饮用超过两杯牛奶的人更易患前列腺癌[16]；纽约的一项研究也有类似的结果，其OR值为2.49[17]。另外有研究表明雌激素极有可能对婴儿和青少年的生长发育造成严重影响，尽管目前尚无直接证据，但多国政府已给予了高度重视。相比于人类而言，雌激素对于哺乳动物的影响已日趋显现。JonathanJLi[18]以仓鼠肾脏腺癌为模式探究不同雌激素与肿瘤发生的关系，试验结果表明己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚在仓鼠中诱导肿瘤发生的机率是相同的。而雌激素促使幼鼠性早熟的报道早已屡见不鲜。除此之外，雌激素对于水生生物也有不可估量的影响。IslingerM等[19]研究发现长期暴露在低浓度17A-乙炔雌二醇（50ng/L）中的雄斑马鱼表现出明显的内分泌失调和睾丸发病迹象,导致性器官自溶,同样的现象也出现在江鳕和黑呆头鱼中,而且暴露在雌激素环境中的成年斑马鱼性器官无法再生。2牛奶中雌激素残留的纯化及检测技术牛奶基质比较复杂，含有许多不同种类的大分子物质，如脂肪、蛋白质等，而雌激素残留一般是痕量的，因此在进行分析前往往需要复杂的样品前处理过程。2.1牛奶中雌激素残留的前处理方法2.1.1液液萃取（LLE）液液萃取也称溶剂萃取，是利用提取物在两种互不相溶的溶剂中溶解度或分配系数不同而达到分离的目的，是比较经典的萃取方法，简便，无需特殊器材，但费时，溶剂用量大。目前雌激素分离萃取中常见的萃取剂有丙酮、甲醇、乙腈、二氯甲烷等。BanIvan等[20]利用液液萃取，以乙酸乙酯作为萃取剂，获得了一种天然共轭马雌激素且同时去除了非共轭亲脂性的化合物。2.1.2固相萃取（SPE）固相萃取作为一种常见的预处理技术，是利用固体吸附剂将目标物从液体样品中吸附出来，然后再用洗脱剂洗脱，从而达到分离和富集的目的。固相萃取可分为正相SPE，反相SPE，离子交换SPE和吸附SPE四大类，近年来SPE吸附剂不断推陈出新，如免疫亲和SPE，分子印迹SPE等。其中分子印迹SPE是当前各国研究的热点[21]，它是基于分子识别理论发展而来，虽然发展时间较短，但因其独特的性能而倍受关注，如制备简单、稳定性强、使用寿命长、可抵抗恶劣环境，尤其是可以定做特殊的分子结构和官能团，可特异识别印记分子等。Wang等[22]以雌酮为模板，丙烯酰胺为功能单体，γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷作交联剂，制备出了对雌酮有特异识别和选择性的印迹材料，与液相色谱联用，最低检测限（LOD）可达9.3ng/L。如今，分子印迹领域正逐步引入新的功能特性，如亲水性、超导性、超顺磁性等。2.1.3固相微萃取（SPME）兴起于上世纪末的固相微萃取技术是依托SPE发展而来的一项样品前处理技术，包括直接萃取，顶空萃取和膜保护萃取。与SPE相比，SPME具有溶剂用量少，目标物更易洗脱等特点，但美中不足的是，它的精密度较低，且无法有效地分离一些极性差异较小的物质（如植物色素等）。Yang等[23]采用碳纳米管强化固相微萃取技术联合液相色谱检测牛奶中的己烯雌酚，经检验该方法快速简便，效果良好，且LOD为5.1μg/L，适于日常饮用牛奶的分析。2.1.4液相微萃取（LPME）液相微萃取技术集分离、浓缩、进样于一体，其基本原理与LLE相似，是微型化了的LLE，LPME仅使用很少的有机溶剂，就可对微量目标物产生良好的富集作用，其不足之处在于重现性较差，萃取剂体积不易控制等。顾东海等[24]采用液相微萃取-气相色谱质谱法，以苯为萃取剂，检测奶粉中的双酚A，结果显示该方法相对标准偏差为4.9％，LOD为0.2μg/kg，加标回收率为100.9％～103.4％，方法快速准确，适于此类分析。2.2牛奶中雌激素残留的仪器分析检测方法2.2.1气相色谱法（GC）气相色谱法是利用样品中不同物质在气相和固定液液相间的分配系数不同而实现分离，以气体为流动相（如氮气、氢气等），传质速度快，固定相一般由固定液涂渍在载体上制备而成。虽具高效和高灵敏性的特点，但只对可气化且不易分解的物质有效，而且进样量不易固定。在雌激素的检测中，GC往往采用雌激素先与二氯乙酰氯衍生，然后用电子捕获检测器检测，虽然灵敏度较高，但由于衍生化步骤较为复杂且很难控制过程中产生的水解反应，所以此方法的应用受到一定限制[13]。2.2.2高效液相色谱法(HPLC)作为一种较为成熟的理化检测方法，高效液相色谱在农兽药残留领域应用广泛，它是利用物质在两相中吸附或分配系数的微小差异，配以高压泵，从而实现快速分离。与GC相比，液相可分析不易挥发或热稳定性强的组分，适用范围广，但分析时间相对较长。HPLC按液相分离模式可分为正相，反相和离子交换等，其中以反相HPLC发展最快，且已成为大多数雌激素残留的常规检测方法。周建科等[25]以乙腈-水作流动相，建立了同时测定牛奶中五种雌激素的液相色谱法，分离效果良好，误差小，平均回收率为67.0%~95.5%，LOD为1.0~2.0μg/L。2.2.3毛细管电色谱法（CEC）作为一种新兴的微柱电分离技术，CEC是以电渗流为驱动力，兼具毛细管电泳及HPLC的双重分离机理，具有样品用量少，灵敏度高等优点，但CEC在操作中容易产生气泡，造成电流不稳，影响试验结果。近来发展的加压毛细管电色谱（pCEC），通过将高压直流电场引入CEC中，克服了气泡问题，分辨能力极大提高，尤为适用于分析结构及荷质比均相似的一类化合物。Liu等[26]采用梯度加压毛细管电色谱法，有效地分离了己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚，且三种雌激素的检测限在1.2~2.2×10−7mol/L范围内。2.2.4气相色谱-质谱联用方法（GC-MS/MS）联用技术因其可以取长补短，能集分离、定性(分子结构)和定量于一身，是现代农兽药残留分析的重要发展方向。GC-MS/MS将气相色谱与质谱结合，具有分离能力强，灵敏度极高等特点，且定性、定量数据准确，在雌激素的分离与检测中发挥重要作用。目前GC-MS/MS技术已相当成熟，面对日益加剧的环境污染，关于GC-MS/MS在测定各环境组分中雌激素残留的研究日益活跃，邓晓丽等[27]用GC/MS法对奶粉中四种雌激素雌酮、雌二醇、雌三醇和炔雌酮进行检测，分离效果良好，且在低浓度下的加标回收率为61.2~85.4%，LOD为0.13~0.3ng/g，方法可靠。2.2.5高效液相色谱-质谱联用方法（HPLC-MS/MS）与HPLC通过保留时间对物质定性不同，HPLC-MS/MS通过电子将物质击碎，然后经核质比来定性，相对来说更为准确；同时它弥补了GC-MS的不足，可对热稳定性差，强极性物质以及生物大分子（如蛋白、核酸等）进行分离，这也因此使LC-