猪氟烷基因多样性检测

猪氟烷基因多样性检测hxc广东第二师范学院生物与食品工程学院12生物科学摘要：从猪肌肉中提取DNA，用特异性引物进行PCR-AFLP扩增法对广州市赤岗市场所售10头猪的猪肉进行氟烷基因检测，以鉴定该市场猪肉肉质的好坏。结果表明，在所测定猪样本中，多为阴性纯合子（HaLNN）型，少数为杂合子（HaLNn）型，并没有出现肉质不好的阳性纯合子（HaLnn）型。关键词：氟烷基因PCR扩增凝胶电泳猪应激综合征（PSS）易导致猪应激而突然死亡或产生白肌肉，给养猪业造成巨大的经济损失。PSS是由于氟烷基因（Hal）或称骨骼肌兰尼定受体基因（RYR1）突变所致，兰尼定受体基因CDS序列的C1843→T1843突变致使受体蛋白的第615位的氨基酸发生变异（Arg→Cys），引起蛋白结构和功能的改变；这种改变使猪在应激状态下肌肉组织中大量的Ca2＋异常释放，引起血浆β－内啡呔过量分泌，电解质代谢出现紊乱，发生肌肉持续收缩，进而使猪产生恶性高热；肌肉组织收缩需要大量能量，氧化分解供能不足，需要依靠糖酵解低，出现PSE肉。［1］内切酶HhaⅠ能识别野生型HalN基因的5’－GCG↓C－3’，即C1843位点，因此，可利用内切酶HhaⅠ检测C1843→T1843突变位点来判断猪的应激敏感性。1试验材料1.1试验材料的采集购买广州市赤岗市场上10头猪的新鲜猪肉。1.2试剂及仪器PCR反应相关试剂：含有镁离子的PCR缓冲液，特定的上下游引物，TaqDNA聚合酶，灭菌双蒸馏水。凝胶电泳相关试剂：琼脂糖，1×TAE或者1×TBE缓冲液等，上样缓冲液（Loadingbuffer），溴化乙锭（EB）。酶切相关试剂：HhaI限制性内切酶，酶切缓冲液等。冰箱、离心机、微量移液器、电泳槽、电泳仪、PCR仪、紫光灯、PCR扩增试剂盒等。2.试验方法2.1猪肌肉DNA的提取取200mg猪肉，置于1.5ml离心管中，剪碎，添加600μL裂解液和3μL蛋白酶K，55℃水浴过夜消化。向离心管中加入Tris-饱和酚300μL，氯仿288μL，异戊醇12μL（25:24:1）室温振荡15min，1200r/min离心10min,溶液会呈现三层：上清、中间层和酚层。吸取上清液置于新的1.5mL离心管。加入700μL异丙醇，上下颠倒轻轻晃动，直至白色絮状DNA出现。以1200r/mim离心10min，弃上清，再加入75%乙醇700μL，轻轻晃动，将DNA晃动在溶液中漂浮。以1200r/min离心10min，弃上清液留下沉淀，室温干燥10min.向沉淀加入100μL双蒸水，放在4℃条件下溶解，备用。2.2琼脂糖凝胶电泳检测猪总DNA质量2.2.1琼脂糖胶的制备称取0.6g琼脂糖、60mLTAE置于三角瓶中，煮沸，直至看不到固体。轻轻晃动，赶出气泡。待温度降至50℃—60℃，加入1μLEB染料。导入平板槽内，冷却固定后，拔出齿梳。2.2．2电泳将凝胶取出，放在水平电泳槽中，倒入1×TBE溶液，将凝胶完全浸没。取3μLDNA提取物，并与7μL100dingBuffer溶液混匀，将其点入梳孔中；同时在第一个一梳孔中加入Mark⁃er。接通电泳仪电源，150V电泳30min，最后关闭电源，紫光灯下进行观察或拍照。2.3PCR扩增猪氟烷基因2.3.1PCR反应体系的配制按照如下比例配制，反应体积为20μL。各成分的用量如下（表1）：表1PCR反应体系（20μL）成分体积(μL)5×Buffer（含Mg2+）4×12=48dNTPs1.6×12=19.2TaqDNA聚合酶0.4×124.8上游引物0.4×12=4.8下游引物0.4×12=4.8ddH2O12.2×12=146.4将上述溶液置于1.5mL离心管中，然后各吸取19μL置于PCR小管中。然后，向每个PCR管中加入1μLDNA提取液。2.3.2PCR扩增将混合好的PCR溶液置于PCR仪中，反应条件为30个循环，预变性95℃、5min；进入循环94℃、30s,56℃、30s,72℃、30s；72℃延伸10min。2.3.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测取5μLPCR物，并与3μL100dingBuffer溶液混匀，将其点入梳孔中；同时在第一个一梳孔中加入Mark⁃er。1%琼脂糖凝胶电泳（150v）30min.紫外灯下进行观察或拍照。2.4AFLP检测猪氟烷基因多态性取PCR产物10μL，加入HhaI内切酶0.3μL和10×Buffer2μL，加超纯水至20μL，混匀。37℃恒温5min.全部产物用2%琼脂糖凝胶电泳（150v）30min，在紫光灯下观察并记录结果。3试验结果与分析3.1猪总DNA质量检测结果与分析如图1.猪DNA样品经过染色、琼脂糖凝胶电泳后得到较亮的橘色条带，说明我们提取到了足量的猪基因组DNA并成功染上颜色，可以进行后续实验。如果没有显示出橘色条带，说明没有提取到猪基因组DNA，其原因可能是我们在处理猪肌肉组织块时，裂解不够彻底，提取量不够，导致无法支持后面实验的耗损。图1猪DNA质量琼脂糖凝胶电泳结果3.2猪氟烷基因的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果与分析10个样品DNA模板经PCR扩增，目的片段全长660bp(含上、下游引物),无杂带（图2）12345678910M图2PCR扩增氟烷基因琼脂糖凝胶电泳结果M—2000bp的DNAmarker3.3AFLP检测猪氟烷基因多态性结果与分析氟烷基因PCR产物HhaI酶切结果见图3.PCR产物经内切酶HhaI酶切后，基因未发生突变时，内切酶HhaI可将PCR扩增的特异片段酶切成495bp和165bp两条带，则可判定基因型为NN，即阴性纯合。有当氟烷基因两个位点都发生突变（C1843→T1843）时，HhaI限制内切酶识别位点消失，660bp扩增的片段不能被酶切消化，电泳后只有一条带，基因型为nn，即阳性纯合。当一个氟烷等位基因发生突变（C1843→T1843），而另一个正常，用HhaI酶切可以观察到660bp、495bp和165bp3条带，其基因型为Nn，即杂合。［２］图3中的样品7和9电泳图有495bp和165bp两条带，所以阴性纯合子（HaLNN）型。样品4的电泳图谱含660bp、495bp和165bp3条带，应为杂合子（HaLNn）。其他样品没有显示2000bp1000750500250100660bp出橘色条带，说明该样品在前面的PCR扩增时失败，或在DNA的提取中，裂解不够彻底，提取量不够，导致无法支持后面实验的耗损。在3种检测成功的样品中，并没有出现能降低肉质的阳性纯合子（HaLnn），说明该市场的猪肉肉质良好。M12345678910图3氟烷基因Hhal酶切琼脂糖凝胶电泳结果M—2000bp的DNAmarker；4—Nn型7、9—NN型；4.讨论4．1氟烷基因对猪肉品质的影响氟烷基因是影响肉质的一个主效基因，是产生PSE肉和DFD肉的遗传基础，因此，对Hal基因型分析是杂交培育优良肉质猪的可靠依据之一。HalNN型猪肌肉Hart透过率比HalNn猪的高，而挥发性盐基氮含量要低些，这说明在屠宰后的鲜肉中，肌肉蛋白变性的速度前者比后者缓慢，形成劣质肉的可能性要小。肌肉Hart透过率是评定肌肉蛋白变性程度的重要指标，一般认为，Hart透过率越小，肌肉蛋白变性程度越大，肌肉保持水分的能力越小，劣质肉的发生概率增大。4.2AFLP标记的基本原理及和特点现有的分子标记技术大体上可以分为两类:(1)以分子杂交为基础的分子标记,其代表性技术是限制性片段长度多态性（RFLP）;(2)以PCR为基础的分子标记。如随机扩增多态性（RAPD）、序列特异性扩增区（SCAR）简单串联重复序列（SSR）、扩增片段长度多态性（AFLP）等.AFLP是RFLP与RAPD相结合的一种分子标记技术,既具有RFLP标记的专一性、可靠性,又具有其中RAPD标记的随机性、方便性,因此被称为最有力的分子标记或下一代分子标记。［３］由于该标记是通过选用不同的内切酶达到选择性扩增的目的,因此又被称作选择性限制片段扩增标记SRFA。AFLP技术的基本原理是对基因组酶切片段进行选择性扩增.具体是利用限制性内切酶切割基因组DNA,形成酶切位点不同、分子量大小不等的随机性酶切片段.在其两端接上双链人工接头,形成接头的酶切片段,即DNA模板.特异性片段经变性、退火和延伸周期性的循环而被扩增,长度不同的扩增片段即多态性片段则可通过变性聚丙烯酰胺凝电泳分子筛的作用进行检测.5.结论广州市赤岗市场所售猪肉的氟烷基因型，多为阴性纯合子（HaLNN）型，少数为杂合子（HaLNn）型，并没有出现肉质不好的阳性纯合子（HaLnn），该市场所售猪肉肉质良好。20001000750500250100660bp495bp165bpbp参考文献：［1］严雪瑜，黄云，严小东，蒋钦杨，等．广西巴马小型猪氟烷基因PCR－RFLP分析．［J］湖北农业科学．２０１２，51（18）：４１４４－４１４６［2］祁永旺，王昕陟，侯华，张翠，王金旭．PCR-RFLP法快速测定种猪氟烷基因型及其使用优点［J］．饲料博览，２０１１，（０２）：２７－３０［3］李珊,赵桂仿．AFLP分子标记及其应用［J］．西北植物学报2003,23(5):830—836