环境微生物实验

实验报告课程名称：_______________________________指导老师：________________成绩：__________________实验名称：_______________________________实验类型：________________同组学生姓名：__________一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、主要仪器设备（必填）四、操作方法和实验步骤五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析（必填）七、讨论、心得一、实验目的和要求1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的实用技术和维护知识。3、在油镜下观察细菌的几种基本形式。4、采用悬滴法在高倍镜下观察细菌运动。二、基本内容和基本原理（一）普通光学显微镜的构造普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成。1、机械系统机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。（1）镜座：它是显微镜的基座，可视显微镜平稳地放置在平台上。（2）镜臂：用以支持臂筒，也是移动显微镜时手握的部位。（3）臂筒：它是连接目镜和接物镜的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3—5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜，转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而导致损坏。专业：________________姓名：________________学号：________________日期：________________地点：________________装订线（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；装有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后或左右移动。有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。（6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物镜更清晰。粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。2、光学系统光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。（1）目镜：它的功能是把物镜放大的物象再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称为场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小，故又称它为视野光阑。标本成像于光阑限定的范围之内，在光阑上粘一小段细发可用作指南针，指示视野中标本的位置。再进行显微测量时，目镜测微尺被安装在视野光阑上。目镜上可有5×、10×、15×、20×等放大倍数。可按需使用。（2）物镜：它的功能是把标本放大，产生物像。物镜可分为低倍数（4×或10×）、中倍镜（20×）、高倍镜（40×~60×）和油镜（100×）。一般有油镜上刻有“OI”或“HI”字样，有的刻有一圈红线或黑线，以示区别。物镜上通常标有放大倍数、数值孔径、工作距离、及盖玻片厚度等参数。以油镜为例，100/1.25表示放大倍数为100倍，NA为1.25；160/0.17表示镜筒长度160mm，盖玻片厚度等于或小于0.17mm。（3）聚光器：聚光器又称聚光镜，它的功能就是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。聚光器安装在镜台下，可上下移动。使用低倍物镜时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。聚光器上附有虹彩光阑，通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱。在观察透明标本时，光圈宜调得相对小一些，这样虽会降低分辨力，但增强反差，便于看清标本。（4）反光镜：它是普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。反光镜安装在聚光器下方的镜座下，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。反光镜的一面是凹面镜，另一面是平面镜。一般情况下选用平面镜、光量不足时可换用凹面镜。（二）普通光学显微镜的性能1、数值孔径数值孔径（NA）又称开口率，是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积。可用式1-1表示。其中n为物镜与标本之间介质的折射率，α为镜口角。物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关，数值孔径越大，物镜的性能越好。因为镜口角α总是小于180°，所以sin(α/2)的最大值不可能超过1.又因为空气的折射率为1，所以以空气的介质的数值孔径不可能大于1，一般为0.05-0.95。根据式1-1，要提高数值孔径，一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率。使用香柏油浸没物镜理论上可将数值孔径提高至1.5左右；实际数值孔径也可达到1.2-1.4。2、分辨率分辨率是指分辨物象细微结构的能力。分辨率常用可分辨出的物象两点间的最小距离（D）来表征（式1-2）。D值愈小，分辨率愈高。式1-2中，λ位光波波长。比较式1-1和式1-2可知，D可表示为：根据式（1-3），在物镜数值孔径不变的条件下，D值的大小与光波波长成正比。要提高物镜的分辨率，可通过两条途径：①采用短波光源。②加大物镜数值孔径。3、放大率普通光学显微镜利用物镜和目镜来放大图像，采用普通光学显微镜观察标本时，标本先被物镜第一次放大，再被目镜第二次放大。所谓放大率就是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。4、焦深一般讲焦点所处的像面称为焦平面。在显微镜下观察标本时，焦平面上的物像比较清晰，但除了能看见焦平面上的物像外，还能看见焦平面上面和下面的物像，这两个面之间的距离称为焦深。数值孔径和放大率越大，焦深越小。三、主要仪器设备1、菌种：培养12-18小时的枯草杆菌斜面拍杨武3-4支。2、标片本：细菌三种基本形态的染色标本、特殊形态细菌染色标本。3、仪器及相关用品：显微镜、油、乙醚酒精溶液、擦镜纸。4、其他用品：盖玻片、凹玻片、吸水纸、酒精灯、接种环、牙签、凡士林等四、操作方法和实验步骤（一）显微镜（油镜）操作。1、领取并检查显微镜。2、调节光源：降低背景旋转到工作位置，用粗调螺旋提升镜筒，使镜头距离载物台10mm左右，降低聚光镜位置，完全打开彩虹光阑，一边看目镜，一边调节反光镜镜面角度。然后调节聚光镜位置，直至视野内得到均匀适宜的光亮。3、低倍镜观察：使用低倍镜观察，视野较广，焦深较大，便于搜寻目标，因此宜从低倍镜开始观察。将载玻片标本置于载物台中央，用压片夹定，并将标本部位移动到正中，转动调节粗螺旋，使镜头与标本距离降到10mm左右。然后一边看目镜视野，以便调节粗螺旋缓慢升高镜头，至视野内出现出现物像，改用细螺旋，继续调节焦距和照明，并获清晰的物像，并将所需部位移动到视野中央，再换中、高倍镜观察。4、中、高倍镜观察：依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位，并随着放大倍数的增加，逐步提升聚光器增强光线亮度。找出所需目标，并将其移至视野中央。5、油镜观察：将聚光器提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜形成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，把油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调焦螺旋，直至看清物像。如果上升至离开油面还未看清还未看清，则需重新调整。可从侧面注视，小心地转动粗调节器将镜头重新浸在油中，但不能让镜头压在标本上，以免击碎玻片，损坏镜头。6、用后复原：观察完毕，转动粗调螺旋提升镜筒，取下载玻片，先用擦拭纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦面纸蘸取少许少许二甲苯或1:1乙醚酒精溶液，擦去镜头上的残留油痕，再用干净的擦镜纸擦去洗镜液。降低臂筒，将物镜转成“八”字形置于载物台上。降低聚光器，避免聚光器与物镜相碰。使反光镜垂直于镜座，以防受损。（二）细菌形态观察1、结合显微镜的使用，观察细菌的三种基本形态，包括球菌、杆菌以及螺旋菌。2、看示范镜，观察葡萄球菌、四联球菌、链球菌、炭疽芽孢杆菌的芽孢、钾细菌的夹膜、枯草杆菌的鞭毛。（三）细菌运动性观察有些细菌具有鞭毛，能在水中自由运动。本实验中运用悬滴法观察。悬滴法：取一洁净的盖玻片，用牙签挑取少量凡士林，涂抹于盖玻片四角；再按无菌操作要求，用接种环从斜面底部去培养12—18小时的枯草杆菌菌液一环，置盖玻片中央；接着取凹玻片一块，将凹窝向下覆盖在带有菌液的盖玻片上；翻转凹玻片，使液滴悬于盖玻片表面。悬滴片制成后，先用低倍镜找到水滴，再换高倍镜观察，可以看到活跃的细菌运动。五、实验数据记录和处理实验名称：_______________________________姓名：________________学号：__________________六、实验结果与分析（一）实验结果1、通过显微镜观察，可以发现细菌存在球菌、杆菌、螺旋菌三种形态。2、在示教片观察中，葡萄球菌和四链球菌的细菌聚集形状不同，葡萄球菌聚集的形状像一个葡萄并且聚集细菌数量较多，而四联球菌则只有四个球菌聚集在一起。3、我们可以通过观察炭疽芽孢杆菌了解到芽孢的形状，透过钾细菌观测荚膜，透过枯草杆菌观测鞭毛。同时上述三种细菌不同于葡萄球菌、四链球菌的细菌聚集方式，是单个细菌分散分布。4、悬滴法观测带鞭毛的细菌运动时可以观测到带鞭毛的细菌运动是没有规则的，且运动速度较快。（二）实验分析1、当需要移动光学显微镜时，不能够单手拎镜臂，需要用右手紧握镜臂，左手托住镜座。装订线P.2、观察标本时，应该严格按照低倍、中倍、高倍、油镜的顺序依次使用，同时在调焦时，要依次转动粗调焦螺旋和细准焦螺旋。在使用高倍镜、油镜时，不能够转动粗调焦螺旋降低镜筒，以免造成玻片的碎裂或者镜头的损坏。3、在观察细菌运动性观察的实验中，可不使用油镜进行观测。而在其他需要使用油镜观察的操作中一定要在低倍、中倍、高倍观察时确保视野中的物像是相对较为清晰的，否则会造成在油镜观察时寻找不到清晰的物像，导致需要重新进行实验。（三）、实验心得第一次在大学接触到显微镜的使用以及对细菌的观察，我认为总的来说我能够依靠老师的讲解以及正确的操作顺序顺利得到清晰的物像。整个实验过程需要较强的耐心和细心，找到一个清晰的物像需要较长时间的调整，同时要严格按照低倍、中倍、高倍、油镜的顺序，一不小心就有可能需要重新进行操作。七、思考题1、使用显微镜的油镜时，为什么必须使用镜头油？当使用普通高倍或低倍物镜时,透镜的孔径较大,所以射入物镜的光线因为折射而损失的比率不高,对观察影响不大.但油镜由于需要放大更高的倍数,其镜孔径很小,射入的光线很少,视野不明亮,物象模糊不清。加油的目的就是让油镜与载物玻片之间加一层与玻璃折光率相近的香柏油介质,使通过的光线不产生或少产生折射,增加进入透镜的光线,使视野亮度增加,能更清楚的观察物象。2、比较低倍镜及高倍镜和油镜在数值孔径、分辨率、放大率和焦深方面的差别。镜头数值孔径分辨率放大率焦深低倍镜0.25110010大高倍镜0.6542340中油镜1.25220100小由上述表格可以看出，低倍镜和高倍镜的NA都小于1，而油镜NA大于1；从低倍镜、高倍镜到油镜，分辨率不断增大，焦深不断减小。3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不直接用高倍镜或油镜观察？使用低倍镜可以较快较为准确地寻找到物像，且不易造成玻片的损坏，在低倍镜找到物像后再依次使用高倍镜、油镜时，只要稍加调焦便能够得到清晰的物像。而如果直接使用高倍镜或者油镜，则很难寻找到物像，同时有可能还会由于物镜和玻片位置过于接近而导致玻片或者物镜的损坏。4、简述芽孢、鞭毛、荚膜的染色原理。芽孢染色：用着色力强的染色剂孔雀绿在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而进入芽孢一经着色则很难被水洗脱色。当用复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更容易区分。鞭毛染色：细菌的鞭毛极细，直径一般为１０～２０ｎｍ，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用镀银法染色。荚膜染色：由于荚膜与染料间的