硫酸长春碱温敏性凝胶的释药特性和抗血管生成活性研究

硫酸长春碱温敏性凝胶的释药特性和抗血管生成活性研究符旭东1，胡江红，鲁有祥，张孟佑（广州军区武汉总医院药剂科，武汉，430070）摘要目的考察硫酸长春碱（VBL）温敏性凝胶的释药特征，并评价其抗血管生成活性。方法以单甲基聚乙二醇－羟基乙酸共聚物（MPEG-PLGA）为材料制备VBL凝胶，运用高效液相色谱法测定VBL凝胶的载药量和释放度，采用鸡胚尿囊膜（CAM）实验考察不同剂量的VBL凝胶对CAM血管的抑制作用。结果随着MPEG-PLGA溶液浓度的增加，溶液发生相转变的温度降低，20％MPEG-PLG溶液在37℃左右胶凝。VBL凝胶在2h表现出10％～30％的突释，随着MPEG-PLGA的浓度的增加，突释量减小。2h以后凝胶的释药速度减慢，第3d以后释药速度又呈现出加快的趋势，10％和20％的水凝胶在10d的累积释放度为80％左右。VBL凝胶高剂量组（5.6×10-3pg/个鸡胚）和低剂量组（2.8×10-3pg/个鸡胚）均能明显抑制CAM小血管的生成(P0.01)，其中高剂量组还能够明显抑制大血管的生成(P0.05)。低剂量的VBL凝胶剂对CAM小血管的抑制作用明显优于相同剂量的水溶液(P0.01)，高剂量的VBL凝胶剂对CAM大、小血管的抑制作用与相同剂量的水溶液相当（P0.05）。结论VBL温敏性凝胶具有明显的缓释特征，通过低剂量持续作用的方式可以明显地抑制CAM血管生成。关键词：硫酸长春碱;单甲基聚乙二醇－羟基乙酸共聚物;温敏性凝胶；鸡胚尿囊膜；血管生成抑制剂Studiesondrugreleasecharacteristicandanti-angiogenicactivityofVinblastinesulfatethermosensitivehydrogelsXu-dongFu,JianghongHu，You-xiangLu,,Meng-youZhang（WuhanGeneralHospitalofGuanzhouCommand,Wuhan430030,China）ABSTRACT：OBJECTIVEToexaminedrugreleaseprofileofvinblastinesulfate(VBL)thermosensitivehydrogelsandevaluateitsanti-angiogenicactivity.METHODSVinblastinesulfatehydrogelswerepreparedwithMPEG-PLGA.HPLCwasusedtodeterminedrugcontentandinvitroreleaserate.Theanti-angiogeniceffectinvivowasevaluatedonchickenchorioallantoicmembrane(CAM)neovascularisationmodel.RESULTSGelationtemperaturewasdecreasedwiththeconcentrationofMPEG-PLGAimproved.20%MPEG-PLGAsolutionbecameagelstateatphysiologicaltemperature(37℃).VBLhydrogelsemerged10%~30%burstreleaseat2h,initialburstreleasewasdecreasedwiththeconcentrationofMPEG-PLGAimproved.Drugreleaseratebecameslowerduring2h~3dandbecamefasterafter3d.About80%ofVBLwasreleasedatday10fromhydrogelsatMPEG-PLGAconcentrationof10%and20％.VBL1基金项目：湖北省自然科学项目（2006ABA007）通讯作者：符旭东，女，副主任药师Tel/Fax:[phone]E-mail:[e-mail]inhibitsmallvesslsformingatthedoseof2.8×10-3pg/eggand5.6×10-3pg/egg,markedlyinhibitedthebigvesselsangiogenesisatthedoseof5.6×10-3pg/egg.Anti-angiogeniceffectonsmallvesselsofVBLhydrogelsatthedoseof2.8×10-3pg/eggwasgreaterthanVBLsolutionatthesamedose.VBLhydrogelsandsolutionatthedoseof5.6×10-3pg/egghadsimilaranti-angiogeniceffectsonsmallandbigvessels.CONCLUSIONVBLhydrogelsexertedaremarkablecontrolledreleasecharacteristicandcouldsignificantlyreduceCAMneovascularisationbycontinueactiononregionatlowerdose.KEYWORDSvinblastinesulfate;MPEG-PLGA;thermosensitivehydrogels;chickchorioallantoicmembrane;angiogenicInhibitor传统抗癌药物长春碱（Vinblastine,VLB）是一种由夹竹桃科植物中提取的干扰蛋白质合成的抗癌药物，易溶于水，对光和热不稳定，主要应用治疗恶性淋巴瘤、绒毛膜癌以及睾丸肿瘤，肺癌、乳腺癌等，有明显的消化道反应和骨髓抑制等副作用，其毒副作用呈明显的剂量依赖性。目前已有研究表明VLB在低剂量、非细胞毒浓度时可表现出强的抗血管生成活性作用[1]。全身给药时瘤体类不能保证有效的药物浓度以及多次给药所产生的耐药性是实体瘤治疗失败的重要原因[2]。VBL可局部注射的缓释制剂可以使药物以低剂量持续作用于病变部位，更好地发挥药物抑制血管生成的作用，降低其毒副作用。目前有关于VBL脂质体的研究[3]，但是还没有关于VLB局部注射缓释制剂的研究报道。VBL可局部注射的缓释制剂有可能拓宽药物的临床治疗范围，使其应用于其他与血管异常增生疾病的治疗，如慢性免疫系统的疾病、卡波氏肉瘤等。聚乙二醇单甲醚/聚乳酸-乙醇酸共聚物（MPEG-PLGA）比聚乳酸-乙醇酸共聚物具有更高的水溶性并表现出温敏性特性。作者以MPEG-PLGA为载体，研究了可进行病变部位局部注射的VBL温敏性凝胶制剂。本文考察了处方对VBL温敏性凝胶体外释药曲线的影响，并采用鸡胚尿囊膜（CAM）试验评价其抗血管生成作用。1材料与仪器硫酸长春碱（武汉远城科技有限公司）；MPEG-PLGA(LA:GA:EO的比例是8：2：1，分子量4000-5000，PEG分子量1000，济南岱罡生物技术有限公司);血管内皮生长因子VEGF（美国PeproTechInc公司）；明胶海绵（江西省南昌市祥恩堂医疗器械有限公司）；SPF种蛋（北京梅里亚维通实验动物技术公司）；甲醇（天津市广成化学试剂有限公司,色谱纯）；其他试剂为分析纯。HP1100型高效液相色谱仪（惠普公司）；80—1离心沉淀仪（上海手术器械厂）；快速混匀器（金坛市科兴仪器厂）；SHZ—82恒温振荡器（国华企业）；OLYMPUS显微镜（日本）；水夹套培养箱（上海实验仪器厂）；SW-CJ-JFD洁净工作台（苏净集团安泰公司）。2方法2.1VBL温敏型凝胶的制备称取MPEG-PLGA适量置于20ml水中，搅拌后静置于4℃冰箱中，并时时振荡，待MPEG-PLGA充分溶胀后，按处方比例加入硫酸长春碱，充分振摇，即得。2.2MPEG-PLGA水溶液相转变温度的测定[4][5]采用文献报道的试管倒转法测定MPEG-PLGA水溶液发生相转变的温度。配制浓度为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％的MPEG-PLGA水溶液凝胶，取1ml置于玻璃试管中，置于水浴中，温度从15℃逐渐升温至40℃，当溶液变成近乳白色，将试管取出记录温度，倒转观察试管中液体的形态，如果30妙中没有液体滑落，就认为溶液已经胶凝。同一浓度平行测定3次。2.3VBL温敏型凝胶载药量和包封率的测定色谱条件C18柱（4.6mm×250mm，5µm），柱温：25℃；流动相：10mM磷酸盐溶液:甲醇（20:80）；检测波长：298nm；流速：1ml•min-1。测定法精密称取凝胶适量（约相当于硫酸长春碱1.5mg），置10ml量瓶中，加乙睛振摇使其溶解，并用乙睛稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。精密称取硫酸长春碱对照品适量，用流动相稀释成15µgmL-1的对照品溶液。精密量取两种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。2.4VBL温敏型凝胶体外释放度的测定[5]精密称取凝胶适量100mg若干份，置10ml离心管中，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液2mL，置于恒温振荡器中，振荡速度为100r•min-1、温度为（37±0.5）℃。分别在1、2、3、5、7d取样，弃掉上清液。依照“2.3”项下方法测定凝胶中硫酸长春碱的剩余量，并计算出累积释放度。每个处方平行操作3次。2.5鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验[6][7]2.5.1开窗SPF种蛋随机分为6组，37℃饱和湿度下孵化至第4天，用尖针在蛋气室表面扎一小孔，使鸡胚尿囊膜与鸡蛋内壳膜分开，照蛋灯下寻找胚头，在胚头右下方0.5～1cm处开窗，并用透明胶带纸封封闭窗口。2.5.2加药继续孵化至第7d后，在CAM表面血管最少处接种一块1mm3的无菌明胶海绵，分别在明胶海绵上滴加12.5μL的VBL温敏性水凝胶（2.8×10-3pg/个鸡胚和5.6×10-3pg/个鸡胚，MPEG-PLGA溶液浓度为20％），药物接种完成后再次封贴窗口，并设置生理盐水组、具有促血管生成作用的VEGF组（5ng/个鸡胚）、具有抑制血管生成的VBL溶液组（2.8×10-3pg/个鸡胚和5.6×10-3pg/个鸡胚）。2.5.3取膜继续培养48h后，轻轻撕开透明胶纸，在CAM表面加入1～2ml固定液（甲醇:甲醛=1:1），15分钟后剪下CAM膜，拍照，并在显微镜下（100×）计数。2.5.4计数及统计学处理根据血管直径（d）将血管分为3类，d＞0.1mm为大血管;0.1mm＞d＞0.05mm为中血管;d＜0.05mm为小血管。根据大、中、小血管根数进行计数，所有数据以均数±标准差（x_±s）表示，组间差异进行显著性t检验。3结果3.1VBL凝胶含量测定的方法学考察在2～12µg•mL-1的范围内硫酸长春碱溶液298nm处测定峰面积(Y)对浓度(X)有良好的线性关系，回归方程为：Y=15.348X-1.4213,r=0.9998。该测定方法低（2µg•mL-1）、中（6µg•mL-1）、高浓度（10µg•mL-1）的平均回收率为（101.4±1.7）％，中浓度（6µg•mL-1）的日间精密度为2.2％（n＝5）。3.2浓度对MPEG-PLGA水溶液相转变温度的影响图1聚合物浓度对MPEG-PLGA水溶液相转变温度的影响Tab1EffectofpolymerconcentrationontransitiontemperatureofaqueoussolutionsofMPEG–PLGA.0102030405001020304050concentration（％）temperature（℃）随着MPEG-PLGA溶液浓度的增加，相转变温度降低。20％的MPEG-PLGA在生理温度37℃左右出现胶凝。3.3载药量对VBL凝胶体外释药速度的影响将凝胶浓度固定在20％，考察载药量0