第02章显微镜技术和显微镜在临床检验中的应用知识扩充

显微镜技术与显微镜—、光学显微镜的发展历史早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。17世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对显微镜的发展做出了卓越的贡献。1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出成就。19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图像信息采集和处理系统。目前全世界最主要的显微镜厂家主要有：奥林巴斯、蔡司、徕卡、尼康。国内厂家主要有：江南、麦克奥迪等。二、主要电镜制备技术介绍由于电子显微镜本身的分辨能力与性能在不断提高，生物样品制备技术在不断改进，以及电子显微镜技术在细胞生物学研究中所发挥的巨大作用，因此，对电镜观察的生物样品有一些特殊要求：（1）要求样品很薄。电子束的穿透能力是十分有限的，即使电场高压增加到100～200kV，电子穿透生物样品的厚度仅达1μm。故此，用电镜观察样品的精细结构时，首先要求样品很薄，一般是数十纳米。即使是细菌与其它单细胞生物，假如不经过超薄切片，内部的细微结构也很难观察清楚。所以，超薄切片（ultrasection）技术是基本的电镜实验技术；（2）要求更好地保持样品的精细结构。一般样品制备都要经过一个复杂的过程：如固定、脱水、包埋、切片、染色等。所以要使样品尽量保持生活状态下的精细结构而不严重失真，对固定剂与包埋剂的选择以及固定与包埋的条件均要求比较严格(一)超薄切片技术由于电子束的穿透能力有限，为获得较高分辨率，切片厚度一般仅为40～50nm，即一个直径为20um的细胞可切成几百片，故称超薄切片。这需要样品既要有一定刚性又要有一定韧性，而生物样品并不具备这些特性。为此，样品往往需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构，所以超薄切片样品制备的第一步就是样品的固定，以更好地保存细胞的精细结构。1．固定如何保持观察样品的真实性，固定是很重要的一环。固定不仅要求保持样品的形态结构不发生改变；有时甚至要求在超微和分子水平上使细胞内部的结构和成分保持在原来的位置上，同时尽量保持原来的性质，如抗原性等。超薄切片常用的固定剂为锇酸和戊二醛等。根据需要选择最合适的固定剂。此外，还可以用物理方法固定，如高频微波。在固定操作过程中，动物的处死和取材都要快速进行，并通常在低温下固定，以防止酶的自溶作用造成破坏，固定的样品块也不宜太大，以便固定剂迅速渗透。表3-2几种固定剂对细胞各成分的固定效果固定剂核酸蛋白质磷脂多糖不饱和脂肪酸锇酸++++++++++戊二醛++++++KMnO4++++++++++++表示相对固定效果2．包埋包埋的目的是要使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好地支撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并能耐受干燥以及观察时的电子轰击、高温和真空挥发。同时要求包埋剂在高倍放大时也不显示其本身结构，还要求在聚合时不发生明显的收缩，以防止样品中细微结构的损坏和移位；应具有良好的机械性能（如刚度和韧性等）以利于切片；应易被电子穿透等。目前常用的包埋剂是环氧树脂。生物样品固定后通常仍含有大量水分，而包埋剂又多是与水不相溶的，因此在包埋前通常要经过一系列脱水处理过程。3．切片超薄切片厚度通常是40～50nm。切片厚度可通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩来控制。切片刀以玻璃或钻石为材料，最常用的是玻璃刀。切片须捞在覆有支持膜的载网（铜网或镍网）上才能在电镜下观察。4．染色样品中的不同成分对各种“染料”有不同的亲和性，如锇酸宜染脂肪；铅盐易染蛋白质；醋酸铀易染核酸等。电镜样品仅用重金属盐进行染色以形成明暗反差，因此只能通过电子束振幅的改变观察到黑白图像。它不能使光镜切片染色，通过改变波长而获得彩色图像。几乎各种细胞超微结构都可以用超薄切片法观察。超薄切片技术显示典型动物细胞的超微结构。不仅如此，超薄切片技术还可以与放射性同位素自显影、细胞化学、免疫电镜和电镜原位杂交等技术结合，用于不同的研究目的。(二)负染色技术某些结构，如线粒体基粒、核糖体和蛋白质及其组成的纤维甚至病毒等可以通过负染色（Negativestaining）电镜技术观察其精细结构。其分辨率可达1.5nm左右。负染色是用重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀，对铺展在载网上的样品进行染色，吸去多余染料，样品经自然干燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构。(三)冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术用快速低温冷冻法将样品迅速冷冻（液氮或液氦中），然后在低温下进行断裂。这时样品往往从其结构相对“脆弱”的部位（即膜脂双分子层的疏水端）断裂。从而显示出镶嵌在膜脂中的蛋白质颗粒，由于冰在真空中的少量升华，可进一步增强“浮雕”式的蚀刻效果。用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差，再经碳垂直于断面进行真空喷镀，形成一个连续的碳膜，然后用消化液把样品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微粒移到载网上进行电镜观察。冰冻蚀刻（Freezeetching）技术主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构，图形富有立体感，样品不需包埋甚至也不需固定，同时能更好地保持样品的真实结构。近年来发展起来的快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）就是在此基础上发展起来的。深度蚀刻主要用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白。(四)电镜三维重构技术生物大分子的三维结构是当今生命科学研究中的核心课题之一。电镜三维重构技术是电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术，尤其适于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质－核酸复合物等大的复合体的三维结构。其基本步骤是对生物样品（如蛋白质二维晶体）在电镜中的不同倾角下进行拍照，得到一系列电镜图片后再经傅立叶变换等处理，从而展现出生物大分子及其复合物三维结构的电子密度图。最早提出并发展这一技术是英国生物物理学家A.Klug，并因此获得1982年诺贝尔化学奖。近年来在此基础上发展了低温电镜技术（Cryoelectronmicroscopy），其样品不经固定、染色和干燥，直接包被在约100nm厚的冰膜中，在电镜内﹣1600℃低温下利用相位衬度成像。该技术不仅更真实地展示出生物大分子及其复合物表面与内部的空间结构，而且还具有更高的分辨率。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。(五)扫描电镜技术扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，简称SEM）是二十世纪60年代才正式问世的。其电子枪发射出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束可激发样品表面放出二次电子（同时也有一些其它信号）。二次电子产生的多少与样品表面的形貌有关。二次电子由探测器收集，并在那里被闪烁器转变成光信号，再经光电倍增管和放大器又转变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，样品不同部位上产生二次电子多或少的差异，直接反映在荧光屏相应部位亮或暗的差别，从而得到一幅放大的立体感很强的图像。扫描电镜主要是用来观察样品表面的形貌特征，而生物样品在干燥过程中由于表面张力的作用极易发生形变，解决这一问题最常用的是CO2临界点干燥法，即利用CO2在其临界温度以上就不再存在气-液相面，也就不存在引起样品变形的表面张力问题，从而完成生物样品的干燥。通常用液态CO2等介质浸透样品，然后在临界温度以上使CO2以气态形式逸去。由于没有气-液相面的形成，也就没有表面张力，样品的形态能得到很好地保持。此外，为了得到良好的二次电子信号，样品表面需良好的导电性，所以样品在观察前还要喷镀一层金膜。扫描电镜景深长，成像具有强烈的立体感，可用于观察核孔复合体等更精细的结构。三、细胞拆合与显微操作技术真核细胞是由细胞核和细胞质两大部分组成的，为了探明核质相互作用的机理，科学家们创建了细胞拆合技术。所谓细胞拆合就是把核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。细胞拆合可以分为物理法和化学法两种类型。物理法就是用机械方法或短波光把细胞核去掉或失活，然后用微吸管吸取其它细胞的核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操纵仪进行操作。化学法就是用松胞素B（cytochalasinB）处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞分拆为核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）两部分。由于核体外表包有一层细胞膜和少量胞浆，因而在PEG或仙台病毒的介导下，核体可同另一胞质体融合，形成重组细胞。显微操作技术（micromanipulation）是早期建立的一种胚胎学技术，即在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射（microinjection）的技术。现在显微操作装置的设计愈来愈精密，不仅用于核移植，而且亦可对细胞核进行解剖和向核内注入基因。细胞拆合、显微注射与现代分子生物学技术相结合使这些经典的胚胎学技术展现出极大的潜力，它不仅成为核质关系、细胞内某种mRNA或蛋白质功能等基础研究的重要手段，而且在转基因动物、高等动物的克隆方面的理论与实践研究中取得重大的突破。四、扫描探针显微镜SPM（ScanningProbeMicroscope或ScanningProbeMicroscopy）是扫描探针显微镜或扫描探针显微术的缩写，是一个大的种类，目前，SPM家族中已经产生了二三十种显微镜，例如扫描隧道显微镜（ScanningTunnelingMicroscope--STM）、原子力显微镜（AtomicForceMicroscope--AFM）、磁力显微镜（MagneticForceMicroscope--MFM）、静电力显微镜（ElectrostaticForceMicroscope--EFM）等等。(一)SPM工作原理扫描探针显微镜(SPM)的工作原理是基于微观或介观范围的各种物理特性，通过原子线度的极细探针在被研究物质的表面上方扫描时检测两者之间的相互作用，以得到被研究物质的表面特性，不同类型的SPM之间的主要区别在于它们的针尖特性及其相应的针尖----样品相互作用方式的不同。STM的工作原理来源于量子力学中的隧道贯穿原理。其核心是一个能在样品表面上扫描、并与样品间有一定偏置电压、其直径为原子尺度的针尖。由于电子隧穿的几率与势垒V(r)的宽度呈现负指数关系，当针尖和样品的距离非常接近时，其间的势垒变得很薄，电子云相互重叠，在针尖和样品之间施加一电