沉底分离法

沉淀分离法组员：李纳林海棠朱仲琳刘钰李琪4.1概述沉淀分离：是一种经典的分离方法，沉淀分离法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，调控溶液中各种成分的溶解度，从而实目标产物于其他物质分离的技术。优点：1.原料易得、流程简单、成本低廉、便于小批量生产。2.产物浓度越高沉淀越有效，收率越高。缺点：所得产品纯度较低。注意事项：1.采用的分离条件，要选择适当的温度、酸碱度等，且沉淀反应必须是可逆的。2.加入溶液的沉淀剂或其他物质要是容易得且在后续精加工易除。3.保证对环境无污染，对人体无毒害作用。4.沉淀剂在待分离的溶液中要有适当的溶解度，且受温度影响应较小。4.2沉淀分离的理论基础4.2.1溶液的稳定性沉淀分离的主要对象的表面有很多亲水集团和疏水基团，大多以胶体形式溶解在提取液或发酵液中，其长期保持稳定的原因有三个。1.布朗运动：悬浮微粒不停地做无规则运动的现象，运动越激烈，胶体粒子越不易聚集沉淀。2.静电斥力：由于胶体分子间的静电排斥作用，形成双电子层，当电子层达到一定程度时，两胶粒间静电斥力强于分子间的相互引力而使胶体处于稳定。3.胶体水化层：当水分子与离子间的相互作用能大于水分子与水分子间的氢键能时，水的结构破坏并在离子周围形成水化层。胶体周围的水化层越厚，稳定性越大。4.2.2沉淀的原理胶体虽具有聚集稳定性，当毕竟属于热力学不稳定体系。许多外部因素会破坏胶体的稳定性。1.温度、机械作用、化学作用等都可以破坏胶体的稳定性。导致溶胶分散度降低，分散相颗粒变大，最后从介质中沉淀析出，这种现象称作聚成。2.电解质可以夺走水分子，破坏水化层，暴露疏水基团，从而使胶体沉淀。3.外因逐渐中和了胶体电荷，使分散层厚度变小，导致紧密层电位降低，静电斥力逐渐减小，分子间相互吸引力加大甚至超越斥力，同时粒子间的布朗运动反而使其聚集沉淀。4.3常用沉淀分离技术•盐析沉淀法•有机溶剂沉淀法•等电点沉淀法•高分子聚合物沉淀法•复合盐沉淀法4.3.1盐析沉淀法盐析沉淀法即在胶体溶液中加入电解质，使胶体微粒聚集，溶解度降低，而从溶液中沉淀出来的方法。该方法适用于蛋白质的分离，可作为蛋白质的粗分离手段。1、盐析原理胶体分子的稳定性胶体分子所带的亲水基团与水分子作用形成水化层，避免相互碰撞而聚集沉淀内层极性基团使分子间相互排斥向溶液中加入大量中性盐后：中性盐破坏水膜，暴露疏水区域；中和电荷，降低颗粒间排斥阻力。胶体分子碰撞聚集，结合成聚集物而沉淀析出。+++++++++++pHpI,带正电，有水膜，是稳定的亲水胶体H+OH-_+++++____pH=pI时,有水膜，是不稳定的亲水胶体H+OH-_________pHpI,带负电，有水膜，是稳定的亲水胶体中性盐破坏水膜+++++++++++中性盐中和电荷SO42-中性盐破坏水膜_+++++____中性盐破坏水膜_________中性盐中和电荷NH4+或Na+2、盐析公式在高浓度盐溶液中，溶质溶解度的对数值与溶液中的离子强度成线性关系。lgS=β–KsIS为蛋白质溶解度β为盐浓度为0时，目的高分子溶解度的对数值I为离子强度3、常用盐析剂Hofmeister理论认为：半径小带电荷高的离子盐析作用较强，半径大带电荷低的离子盐析作用较弱。常见阴离子的盐析作用顺序：PO43-SO42-CH3COOClNO3ClO4ISCN一般盐析作用阴离子阳离子阳离子对盐析效果的影响：Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+4、影响盐析的因素•蛋白质种类•温度和pH值•离子类型•蛋白质原始浓度•盐的加入方法（1）蛋白质种类不同蛋白质的β和Ks值不同，相对分子质量大，结构不对称的蛋白质越容易沉淀。（2）温度和pH值在低离子强度溶液，蛋白质溶解度在一定范围内随温度升高而增加。在高离子强度溶液，升高温度利于某些蛋白质失水，溶解度下降。所以一般盐析不降低温度。在pH等于等电点的溶液中，蛋白质静电荷为零，静电斥力最小，溶解度最低。（3）离子类型相同离子浓度，盐种类的不同，其盐析效果也不同（4）蛋白质的原始浓度蛋白质浓度高时，盐的用量少。但原始浓度过高，溶液中的多种蛋白质会共沉，浓度过低则会消耗大量的中性盐，不利于回收。在进行盐析时要控制蛋白质的浓度在合理范围。5、盐析沉淀法的操作步骤蛋白质溶液冰水浴并搅拌以蛋白质盐析沉淀为例：边搅边加硫酸铵至饱和继续搅拌离心弃去上清，沉淀溶解于1~2倍沉淀体积的缓冲液离心除去硫酸铵6、盐析法的优缺点优点：（1）室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活。（2）非蛋白的杂质很少被夹带沉淀。（3）适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用。（4）设备简单，操作方便。缺点：（1）沉淀物中含有大量盐析剂（2）硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上4.3.2有机溶剂沉淀法在蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能显著降低蛋白质等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。不同蛋白质沉淀时所需有机溶剂的浓度不同，因此调节有机溶剂的浓度，可以使混合物中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。1、基本原理（1）有机溶剂的介电常数比水小，加入有机溶剂后，溶液的介电常数降低，带电的溶质间的库伦引力逐渐增强，相互吸引而聚集。（2）水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与溶质结合的自由水，使其表面的水化层破坏，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生凝聚，沉淀析出。常用于生物大分子沉淀的有机溶剂：甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等其中乙醇是工业上最常用的2、影响有机溶剂沉淀效果的因素•溶液pH值•温度•生物分子的浓度•溶剂的种类及浓度•离子强度•金属离子（1）溶液pH值在等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂沉淀时，溶液pH多控制在蛋白质等电点附近。在控制时要避免溶液中的目的物与其它生物分子带相反的电荷，这会加剧共沉淀现象，造成分离困难。（2）温度有机溶剂存在下，多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著的减小，因此低温下沉淀得完全，有机溶剂用量可减少。温度过高会使蛋白质变性而失活。（3）离子强度低浓度范围内，盐浓度的增加使溶质溶解度升高，即盐溶现象；盐浓度过高时，增加浓度会使溶质溶解度降低，即盐析现象。对盐析后的上清液或沉淀物，如进一步用有机溶剂沉淀法纯化，必须先脱盐，否则会增大有机溶剂的用量。（4）金属离子一些金属离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并减少有机溶剂用量。3、有机溶剂沉淀法的优缺点优点：（1）乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净；（2）有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。缺点：（1）容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行。（2）采用大量有机溶剂，成本较高。（3）有机溶剂易燃易爆，工业生产上车间和设备都应有防护措施。4.3.3等电点沉淀法两性物质在等电点时，分子表面净电荷为零，单个分子间静电排斥作用减小，而发生静电吸引作用，形成比较大的粒子从而产生沉淀。利用蛋白质分子作为两性电解质在电中性时溶解度最低的特性，用依次改变溶液pH的方法可将不同的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。操作中大多通过加入无机酸、磷酸、硫酸、钠盐等调节pH。常与盐析法、有机溶剂法等一起使用。等电点沉淀法多可用于沉淀混合蛋白质中不需要的成分，实际工作中普遍采用该方法作为去杂手段。如在工业上生产胰岛素时：先调pH至8.0去除碱性杂蛋白，再调pH至3.0去除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大大提高，有利于后面的操作。酸碱+++++++++++带正电荷的蛋白质（亲水胶体）_________带负电荷的蛋白质（亲水胶体）_+++++____在等电点的蛋白质（亲水胶体）脱水+++++++++++脱水_+++++____脱水_________碱酸图4—5等电点沉淀原理碱酸带正电荷的蛋白质（疏水胶体）不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）带负电荷的蛋白质（疏水胶体）4.3.4高分子聚合物沉淀某些水溶性的非离子型高分子聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，近年来被广泛用于核酸、蛋白质和酶的分离纯化。因PEG无毒，且对成品影响小，应用最为广泛。一般认为，PEG沉淀的主要机理是通过空间排斥，使溶质蛋白质分子聚集在一起而引起沉淀的发生。PEG沉淀法优点：1.操作条件温和；2.可室温操作；3.不易引起蛋白质的变性或复性；4.沉淀效果强。缺点：1.PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去，需用超滤和液-液萃取解决；2.价格较昂贵。用非离子多聚物沉淀蛋白质等生物大分子的两种方法：选用两种非离子多聚物组成双水相溶液系统，利用生物大分子分配系数的不同，进行分离。在同一液相中，利用非离子多聚物的排斥作用使蛋白质聚集析出。蛋白质溶液中缓慢搅拌加入PEG继续搅拌至完全沉淀沉淀悬浮离心用PEG沉淀蛋白质等生物大分子的操作步骤：图4—5等电点沉淀原理4.3.5复合盐沉淀法生物大分子可以生成盐类复合物以进行沉淀。按生物分子结合功能团的不同复合盐沉淀法一般分为：金属复合盐沉淀法有机酸类复合盐沉淀法无机复合盐（如磷钨酸盐）沉淀法金属复合盐沉淀法金属离子与生物分子的酸性功能团作用，形成金属复合盐，可用H2S气体使金属变成硫化物而除去。有机酸类复合盐沉淀法有机酸离子与生物分子的碱性功能团作用形成有机酸复合盐，可用无机酸并用乙醚萃取或离子交换法除去有机酸。还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是生物体重要的非蛋白巯基化合物之一，广泛分布于动植物细胞和微生物中。目前，国内用发酵法生产GSH发酵水平偏低，导致后续提纯工艺收率低、产品纯度低、质量差、成本高，远远不能满足需求。采用有机溶剂沉淀法处理抽提液，可破坏抽提液中的蛋白质、核酸等大分子物质的空间结构，使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面，并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使这些大分子物质沉淀下来，达到初步分离提纯抽提液的目的。在5℃（GSH对热敏感，在较高温度下易被氧化）有机溶剂选用乙醇，ρ0=6.52g/L，先测定GSH抽提液中GSH初始质量浓度，取若干个100mL烧杯，编号并称重，然后移取10mLGSH抽提液到已编号的烧杯中，加入50ml定容的乙醇与之搅拌混匀，调节混合液的pH至3.0～3.4;恒温静置3h使其沉淀完全后，测定上清液中GSH质量浓度，并计算GSH损失率。沉淀物经过滤、60℃烘箱烘干后，准确称取其质量。在上述条件下处理样品，以GSH标准品1为对比样，采用HPLC对GSH抽提液2和处理后样品3进行纯度分析，结果表明，抽提液原样中GSH纯度仅为18.0%，而处理后样品中GSH纯度可达到41.0%。可见，有机溶剂沉淀法可有效去除GSH抽提液中的杂质，达到了初步提纯GSH的目的，有利于进一步的后续分离纯化。大豆中含35%～40%的蛋白质,根据在超速离心力场中沉降系数的不同,可将大豆主要蛋白分为四类,即15S、11S、7S、2S球蛋白,其中11S球蛋白(即大豆球蛋白)和7S球蛋白(β-伴大豆球蛋白)是大豆蛋白中的两种主要组成成分大豆球蛋白(Glycinin)是大豆中的重要过敏原,可引起人和动物的过敏反应。大豆球蛋白的抗原性源于其组成亚基的抗原性。研究表明大豆球蛋白酸性亚基能引起人和动物的过敏反应,过敏患者血清的IgE抗体能与大豆球蛋白的多种酸性亚基结合但很少能与碱性亚基结合,表明大豆球蛋白的酸性亚基和碱性亚基的致敏性存在差异根据等电点沉淀原理分离纯化大豆球蛋白酸性亚基和碱性亚基,为深入研究大豆球蛋白的酸性亚基和碱性亚基的致敏性差异提供条件。新鲜大豆种子低温粉碎,利用-20℃冷丙酮脱脂,风干后为脱脂大豆粉。将脱脂大豆粉以Tris-HCl缓冲液(pH8.5)室温提取1h(料液比为1∶15),离心(9000r·min-1,30min,4℃)后弃沉淀,上清液为大豆总蛋白提取液。在大豆总蛋白提取液中加入亚硫酸氢钠至0.01mol·L,准确调pH至6