沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性

中国组织工程研究第20卷第28期2016–07–01出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJuly1,2016Vol.20,No.28ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4149·研究原著·王俊，男，1979年生，湖北省黄石市人，汉族，2004年咸宁医学院毕业，主治医师，主要从事肿瘤及肿瘤疾病相关学科研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)28-04149-06稿件接受：2016-05-04沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性王俊，王建中(武汉钢铁(集团)公司第二职工医院肿瘤科，湖北省武汉市430085)引用本文：王俊，王建中.沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性[J].中国组织工程研究，2016，20(28):4149-4154.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.007ORCID:0000-0002-9995-8862(王俊)文章快速阅读：文题释义：ABCE1基因：属ATP结合盒转运子基因亚家族成员之一，与细胞生长、发育和增殖、分化有密切关联，其在人体各组织器官中均持续表达。相关研究表明，在肿瘤细胞系中抑制ABCE1的表达能够显著抑制癌细胞的生长，因此如能阻断肿瘤细胞中ABCE1的表达，通过抑制肿瘤细胞的增殖分化、侵袭、迁移及蛋白质的合成，就可以抑制肿瘤的发展，这为肿瘤的治疗提供了新的有效方法。肿瘤干细胞：从本质上讲，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力，肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能；肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后一段时间复发。摘要背景：对肿瘤干细胞相关基因ABCE1的深入研究有可能会发现它在参与恶性肿瘤的发生及进展等方面的重要作用。目的：观察沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞的增殖特性及对β-榄香烯乳的敏感性。方法：设计合成ABCE1的siRNA序列，通过电转染入卵巢癌肿瘤干细胞。RT-PCR和Westernblot检测ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞ABCE1mRNA及蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞周期变化，MTT法和细胞克隆形成实验分析ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性。结果与结论：①ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞的ABCE1基因和蛋白表达明显降低；②ABCE1基因沉默后细胞周期被阻滞在G0/G1期，S期细胞数减少；③ABCE1基因沉默后β-榄香烯乳对卵巢癌肿瘤干细胞的增殖抑制率和克隆形成抑制率显著增加；④结果表明，沉默ABCE1基因能显著抑制卵巢癌肿瘤干细胞的增殖能力，并能增强肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；卵巢癌；ABCE1；细胞增殖；β-榄香烯乳主题词：卵巢肿瘤；肿瘤干细胞；基因沉默；组织工程ABCE1silencingenhancessensitivitytobeta-eiemeneofelectrotransferredovariancancerstemcellsWangJun,WangJian-zhong(DepartmentofOncology,theSecondWorkers’HospitalofWuhanIronandSteel(Group)Company,Wuhan430085,HubeiProvince,China)ABCE1基因沉默电转染卵巢癌肿瘤干细胞增殖特性及对β-榄香烯乳敏感性的影响电转染卵巢癌肿瘤干细胞设计合成ABCE1的siRNA序列(1)ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞的ABCE1基因和蛋白表达明显降低；(2)ABCE1基因沉默后细胞周期被阻滞在G0/G1期，S期细胞数减少；(3)ABCE1基因沉默后β-榄香烯乳对卵巢癌肿瘤干细胞的增殖抑制率和克隆形成抑制率显著增加。沉默ABCE1基因能显著抑制卵巢癌肿瘤干细胞的增殖能力，并能增强肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性王俊，等.沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性P.O.Box10002,Shenyang110180’HospitalofWuhanIronandSteel(Group)Company,Wuhan430085,HubeiProvince,ChinaAbstractBACKGROUND:ItislikelytofindthatABCE1playsanimportantpartintheoccurrenceandprogressionofcancersthroughin-depthstudy.OBJECTIVE:ToinvestigatetheeffectsofABCE1silencingontheproliferationandsensitivitytoβ-eiemeneofovariancancerstemcellsviaelectrotransfection.METHODS:siRNAsequenceofABCE1wasdesignedandsynthesized,andthenwaselectrotransfectionintoovariancancerstemcells.Subsequently,expressionsofABCE1mRNAandproteininovariancancerstemcellsafterABCE1silencingweredetectedbyRT-PCRandwesternblotassay;thecellcyclewasdetectedusingflowcytometry;thesensitivityofovariancancerstemcellstoβ-eiemeneafterABCE1silencingwasanalyzedbyMTTassayandcolony-formationassay.RESULTSANDCONCLUSION:AfterABCE1silencing,expressionsofABCE1mRNAandproteininovariancancerstemcellsweresignificantlyreduced.AndthecellcyclewasarrestedinG0/G1phase,andthenumberofcellsinSphasesignificantlydecreased.Furthermore,thesensitivityofovariancancerstemcellstoβ-eiemeneafterABCE1silencingwassignificantlyenhanced.Inconclusion,ABCE1silencingcannotonlysignificantlyinhibittheproliferationofovariancancerstemcells,butalsoenhancethesensitivityofcancerstemcellstoβ-eiemene.Subjectheadings:OvarianNeoplasms;NeoplasticStemCells;GeneSilencing;TissueEngineeringCitethisarticle:WangJ,WangJZ.ABCE1silencingenhancessensitivitytobeta-eiemeneofelectrotransferredovariancancerstemcells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(28):4149-4154.0引言Introduction卵巢癌的发病率现今已位居于妇科恶性肿瘤的第3位，其复发率高，晚期生存率低[1-3]，目前临床上采取的手术及化疗虽取得一定疗效，但均难以明显提高患者的生存期[4-6]。近些年来，随着基因技术的发展使其成为卵巢癌研究领域中的热点问题[7]。三磷酸腺苷结合盒转运子E1(ATP-bindingcassetteE1，ABCE1)参与多种肿瘤细胞的增殖、迁移，通过抑制细胞内核糖核酸酶L(RNaseL)的活性来抑制细胞凋亡，是ATP结合盒转运子基因亚家族之一[8-9]。迄今关于ABCE1基因沉默对卵巢癌的作用报道较少[10]。β-榄香烯乳是由中药温莪术挥发油中提取的油状物单体，是一种新型的抗癌药物，其抗癌作用机制可能与诱导细胞凋亡有关[11]。实验旨在探讨ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞特性及对β-榄香烯乳敏感性的影响。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机对照动物实验。1.2时间及地点实验于2014年1月至2015年6月在武汉大学动物实验中心完成。1.3材料人卵巢癌肿瘤干细胞(中国科学院上海细胞研究所)；DMEM培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；RNA提取试剂Trizol、质粒提取试剂盒(厦门百维信生物科技有限公司)；DNA凝胶纯化回收试剂盒(美国Hyclone公司)；AMV反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；RT-PCR两步法试剂盒(美国Klontech公司)；RNA干扰序列(北京赛百盛基因技术有限公司)；cDNA合成试剂盒(大连宝生物公司合成)；siRNA基因片段(上海闪晶生物公司设计并合成)；兔抗人ABCE1多克隆抗体(美国SABC公司)；HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(美国Thermo公司)；β-榄香烯乳(大连华立金港药业有限公司)；流式细胞仪(美国Biorad公司)；生物倒置显微镜(日本TOYOBO公司)。1.4实验方法1.4.1ABCE1的siRNA序列设计合成及转染ABCE1siRNA序列根据参考文献[12]设计，由上海闪晶生物公司设计合成，其正义链为：5’-ATCCGCTACAGCGAGTACGTTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAAACGTACTCGCTTAGCTTTTTTG-3’；反义链为：5’-AATFCAAAAAAGCTACAGCGAGTACGTTTACCCCATCTGTGGCTTCACAGGTAAACGTACTCGCTGTAGCG-3’。阴性对照siRNA正义链为：5’-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAACATACTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3’；反义链为：5’-AATTCAAAAAAGCGAGACCTCAGTATGTTACCCATCTGTGGCTTCACAGGTAACATACTGAGGTCTCGCG-3’。卵巢癌肿瘤干细胞接种于含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基，放置于37℃，体积分数为5%CO2的饱和湿度培育箱中进行培养，每隔2d传代1次，选取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，胰酶消化，PBS清洗，离心，收集肿瘤干细胞，用电穿孔缓冲液重悬，离心王俊，等.沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4151(800×g)，静置5min，清洗细胞3次，重悬于电转液中，离心，转移至电击杯，加入20μg的质粒DNA混匀，置于冰上30min，以电容25μF，电压350V/cm，时间常数T为0.9ms的电转化参数，进行电穿孔。转染ABCE1的肿瘤干细胞在室温中放置30min，接种于含1%双抗、体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基的培养皿中，放置于37℃，体积分数为5%CO2