病毒载体的构建和包装技术

病毒载体的构建和包装技术关键词：细胞系病毒包装质粒细胞标准物质网北京标准物质网由于野生病毒具有感染力和致病性，为实现操作方便、安全以及插入外源基因的要求，要对病毒基因组进行改造。病毒载体的构建和包装的流程如图6-7-4所示，首先要构建病毒包装质粒，然后转染包装许可细胞系，最后收获病毒。1.病毒载体的构建就是将外源基因导入病毒基因组的过程。病毒载体的构建是在病毒原有的基础上，删掉一些不必需或者致病的基因，或者把病毒的结构基因分布到不同的质粒中。(1)反转录病毒载体：慢病毒载体是目前反转录病毒载体中使用较多的病毒载体。如图6-7-5所示由HIV病毒改造而来的慢病毒载体。将外源基因插入到载体质粒上，HIV的结构基因gag、pol、env分布到不同的辅助质粒上。如果将这些质粒共转染于包装细胞系中，就可以获得含有目的基因的病毒。(2)腺病毒载体：对于腺病毒载体和痘苗病毒载体等DNA病毒，由于其基因组较大，普通的PCR、酶切等载体构建方法不易操作，而且容易产生突变。通常采用如图6-7-5B～6-7-5D所示的基因同源重组的方法来进行外源基因的插入。同源重组是指利用同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合的原理，将外源基因导入病毒基因组的过程。同源重组可以依靠与病毒基因组相同的同源序列重组完成，多数情况下会利用穿梭质粒进行同源重组。穿梭质粒上含有与病毒序列相同的同源序列，同时容易导入外源基因。利用穿梭质粒与环形或线性的病毒基因组之间的同源重组，最终将外源基因导入病毒基因组。2.病毒载体的包装当病毒载体已经构建成功后，就要进行病毒载体的包装。通常利用转染包装细胞系的方法获得病毒载体。将病毒载体质粒和包装质粒转染于包装细胞系中(如HEK293T细胞)，转染48小时后即可获得相应的病毒。有些细胞已经整合了病毒包装所需要的结构基因：env、gag、pol。只需要将包装质粒转染到该细胞系中，就可以包装出含目的基因的病毒颗粒，这种方法能够比较简单地获得相应的病毒。例如PT67细胞系已经整合了鼠白血病病毒的结构基因gag、pol、env，直接转染表达siRNA的慢病毒载体pSIREN-RetroQ就可以获得表达相应基因的慢病毒。