流式细胞仪.

第十五章流式细胞技术与流式细胞仪概述•流式细胞仪的定义:流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。•流式细胞术的定义:应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。•1934年Moldavan使悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来，这可谓流式细胞仪的最初模型。•1965年Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色的细胞，给出了细胞中核酸的含量和细胞大小，奠定了多参数流式细胞测量的基础。•1967年VanDilla和LosAlamos采用了Crosland-Taylor设计的层流流动室和氩离子激光器开发出了液流束、照明光轴，检测系统三者互相垂直的流式细胞仪，成为目前各种流式细胞测量仪的基础。•1969年Fulwyler利用Sweet的静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。•80年代以来，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增多，新的荧光染料和细胞标记物的出现，流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。•进入90年代，标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪不仅出现在大专院校和科研单位，它也逐渐进入医院的中心实验室和检验科。第一节流式细胞仪的工作原理一、生物学颗粒分析原理流式细胞技术是在单细胞水平上，对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，现已成为现代医学研究最先进的分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞技术。•生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，染色的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。•鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。1.样品的进入流动室：将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动。2.鞘液的作用：流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。3.信号的产生与接收：染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被光电倍增管和光电二极管接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得细胞的大小和核酸含量等指标。在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。二、流式细胞仪细胞分选原理当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内。第二节流式细胞仪的分类和基本结构一、流式细胞仪的分类流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和科研型。临床型只有分析功能，没有分选功能，操作简便，易学易掌握。科研型既有分析功能又有分选功能，可快速将所感兴趣的细胞分选出来。流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数。狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。狭缝扫描流式细胞仪•被检细胞直径大于激光光斑直径，细胞通过光束时各部分被依次扫描。流式细胞仪的结构可分为流动室及液流驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测与存贮、显示、分析系统；细胞分选系统等五个部分。二、流式细胞仪的基本结构（一）流动室与液流驱动系统•流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。•样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。由右图可知，空气泵产生压缩空气，通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的压力，这样鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。（二）激光光源与光束成形系统激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。由于激光焦点处能量分布为正态分布（见图），中心处能量最高。因此，当样本速率选择高速时，处在样本流不同位置的细胞或颗粒，受激光照射的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同。（三）光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成。滤光片主要分为：1.长通滤光片长通滤光片使特定波长以上的光通过。2.短通滤光片特定波长以下的光通过。3.带通滤光片带通滤光片允许一定波长范围内的光通过（四）信号检测与分析当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，细胞内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。1.散射光信号•射光分为前向角散射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物理参数（或称固有参数）。（1）前向角散射前向角散射与被测细胞的大小有关（2）侧向角散射侧向散射光可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。2.荧光信号当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的性质和数量。2.荧光信号（1）荧光信号线性测量和对数测量线性放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器。（2）荧光信号的面积和宽度•荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA倍体测量时采用面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。•荧光信号的宽度常用来区分双连体细胞。（3）光谱重叠的校正当细胞携带两种荧光受激光激发而发射两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测，但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠。从右图中可以看出，阴影为探测器检测光谱的范围，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。图中点A通过透镜f成像在A’处，而点B通过透镜f成像在B’处。在光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保了A点光源进不了B’点处，B点光源也进不了A’点处。（五）细胞分选器1．小水滴的形成压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径为50μm时，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。若每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆为空白。2．逻辑电路为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪个细胞满足了分选的条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。3．水滴的充电与偏转当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流束上断开后便带有同极性的多余表面电荷。下落的水滴通过一对平行板电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向带负电的电极板偏转，这样就可用容器收集水滴。（六）FCM测量数据的存贮、显示与分析目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队(ListMode)方式。目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光标记物参数数量在逐渐增多。采用ListMode方式可大量节约内存和磁盘容量。第三节流式细胞仪的主要性能指标一、荧光测量灵敏度灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标。一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，现在的FCM均可达到检测小于100个荧光分子的指标。二、仪器的分辨率分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV(CoefficientofVariation)值表示：(δ是分布的标准误差，μ是分布的平均值)或%100CV%1004236.0半高峰高CV三、前向角散射光检测灵敏度前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.2～0.5μm左右。四、FCM分析速度分析速度以每秒分析的细胞数来表示。•当细胞流过光束的速度超过FCM仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会丢失，这段时间称为仪器的死时间。•死时间越短，仪器处理数据越快，一般可达到3000～6000个/秒左右。大型机已达到每秒几万个细胞。五、FCM分选指标分选指标主要包括分选速度、分选纯度和分选收获率。•分选速度指每秒可提取所要细胞的个数。•分选纯度指要分选的目的细胞占分选出细胞的百分比。•分选收获率指被分出的细胞与原来溶液中该细胞的百分比。第四节流式细胞仪应用的技术要求流式细胞分析仪器是一项集多学科知识综合应用的复杂仪器，除了对仪器各方面性能指标有严格的要求以外，在实验设计与样品处理方面也需要有丰富的基础理论及操作经验。一、检测样品制备的重要性因为流式细胞仪测量的是每个细胞所产生的散射光和荧光信号，如果两个或多个细胞间粘连重叠或细胞碎片过多，都会影响信号的收集及所收集信号的真实性，所以制备单细胞悬液是进行流式细胞仪分析最关键的第一步。二、常用的荧光染料与标记染色散射光信号是激光照在细胞上所产生的前向光和侧向光信号。荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧光标记染色后通过激光束激发后所产生的。因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，经过与荧光染料染色后才能上机进行检测。焦宁Y与异硫氰酸荧光素（FITC，530nm）分别是RNA与蛋白质的特异性染料；碘化丙啶（PI，620nm）与FITC双染可测知单个细胞内DNA与蛋白质量的变化；丫啶橙（AO，488nm）染色法不仅可测定单个细胞DNA与RNA含量，还可区分出G0与G1期细胞；若丹明123（rhodamin123）是线粒体特殊染料。三、流式细胞仪操作技术的质量控制在临床检测中，应对各个工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，以保证各项检测数据和指标的可靠性。1．光路与流路校正主要目的在于确保激光光路与样品流处于正交状态，使仪器检测时的变异减少到最小，从而控制仪器的CV值。在流路校正物中，有标准大小的荧光微球，其物理性质、生