流式细胞术的应用

第三节流式细胞术的应用节概述流式细胞术以其快速、准确、灵敏度高等优点，广泛应用于生物细胞周期和动力学的分析、各种肿瘤性抗原、肿瘤性蛋白、致癌基因、检测凋亡、免疫学的理论研究和临床诊断。知识点导航一、流式细胞术在细胞生物学中的应用流式细胞术最早被应用于生物学研究领域，就是生物细胞周期和动力学的分析。Gohode和Dittrich第一个用流式细胞术测量细胞核DNA含量，以了解细胞周期的变化来研究药物干扰细胞周期动力学。目前，流式细胞术在细胞生物学研究中应用最广泛的是生物细胞增殖周期的定量分析。流式细胞术为生物细胞增殖周期的研究带来了全新的分析手段。1．DNA倍体研究的理论依据在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，DNA参量随着细胞增殖周期各时相而发生变化(图17－6)。G0期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即静止期细胞，DNA含量是较为恒定的2C，G1期的细胞具有增殖活性，是参与细胞周期循环的一群细胞，G1期细胞的DNA含量与G0期细胞DNA含量相同，均为2倍体DNA含量，当细胞进入S期后(细胞合成期)，图18-6细胞增殖周期与DNA含量分布直方图DNA含量逐渐增加，从2C变化到4C值，直到细胞DNA倍增结束进入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C值，即为恒定的4C细胞群。荧光染料(如PI)与细胞DNA能够特异性结合，它们有一定的量效关系：1DNA含量与荧光染料的结合成正比；2荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比；3荧光脉冲与DNA直方图的通道值成正比。因此，流式细胞术可根据细胞的DNA含量将细胞分为三部分：G0/G1、S期和G2/M期。G0/G1期和G2/M期细胞峰的DNA分布均成正态分布，S期可认为是一个加宽的正态分布。其中，G2/M期的DNA含量是G0/G1期的2倍，S期的DNA含量介于G0/G1期与G2/M期之间。流式细胞仪配有分析细胞各时相相对细胞数的拟合软件，它可将其测定的DNA直方图进行拟合，计算出细胞周期各时相的百分比及DNA含量。2．DNA指数FCM定量分析一个细胞群，用DNA指数(DNAindex，DI)衡量细胞的变异情况，DI可用下式计算：DI=样品G0(G1)期的均值／正常2倍体细胞G0(G1)期均值从上式可知，正常2倍体细胞的DI=1，如果DI1则说明该群细胞异常。因此，DI是FCM进行肿瘤早期诊断的主要指标。3．DNA分析的意义(1)通过DNA的倍体分析可鉴别良、恶性肿瘤：良性肿瘤或良性增生时不会出现非整倍体细胞(DI1)，而恶性肿瘤则伴有相当数量的非整倍体出现。所以出现非整倍体细胞是恶性肿瘤诊断的有力证据。(2)药物对细胞周期的影响：在抗肿瘤药物的研究中，对其作用机理的研究，一般要观察药物作用在细胞周期的哪个时相，运用流式细胞术可使这方面的工作变得方便、快速、客观。例如推测某种药物作用于细胞的DNA合成期，通过流式细胞仪的检测，发现G2/M期数量减少，则有力地支持了推测的正确性。二、流式细胞术在肿瘤病理中的应用近年来流式细胞术已引起了肿瘤研究工作者的极大关注，尤其是以细胞DNA含量的测定最受重视，而荧光探针的发展，为流式细胞术研究各种肿瘤性抗原、肿瘤性蛋白、致癌基因等开辟了新的途径，极大地提高了肿瘤学的研究水平，使得流式细胞术在肿瘤的鉴别、诊断、治疗和预后方面得到了广泛的应用。以DNA非整倍体与癌前病变的流式细胞术检测为例说明这一技术的应用。癌前病变是早期诊断恶性肿瘤的重要环节，一般认为，正常组织细胞发生癌变有一个从量变到质变的过程。癌前细胞处于量变过程中的转化阶段，细胞的增生程度与DNA含量的异常改变呈平行关系。有学者用流式细胞仪对食管、胃、结肠、宫颈、鼻炎、口腔黏膜、宫内膜等部位的癌前病变做了检测和研究分析，结果表明：1DI在正常细胞中不超过1.05，而随着增生程度增高DI也增高；2在正常组织细胞中不会出现非整倍体细胞，S期和G2/M期的相对细胞数比例不高，当出现非整倍体后，一般DI会随非整倍体上升而上升。这对恶性肿瘤的诊断具有结论性意义。肿瘤细胞DNA的动态变化，可作为指导肿瘤的治疗、了解病情发展过程和判断预后的有力证据。三、流式细胞术在凋亡研究中的应用细胞凋亡又称细胞凋谢或程序性细胞死亡，是有别于细胞坏死而受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是当今生物学领域研究的热门课题之一。流式细胞术检测凋亡的主要方法有：1用荧光染料对DNA降解进行测定，目前最常用的是碘化丙啶(PI)染色，进行细胞周期分析，观察是否有亚2倍体细胞出现(图17－7)。2用Annexin法，基于早期凋亡细胞因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂丝氨酸(PS)暴露于细胞膜外，PS可特异地结合标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的连接素Ⅴ(AnnexinⅤ)，但是细胞仍维持细胞膜的完整性，使变性染色质着色的荧光染料－PI不能进入细胞。然而，坏死或凋亡晚期的继发坏死细胞可同时被AnnexinⅤ与PI标记，利用流式细胞仪可作双参数测定，定量分析出凋亡与坏死的细胞数(图17－8，表17－1)。对照细胞????????????????????????????????????实验细胞图17-7PI染色分析细胞周期与凋亡图18-8Annexin法测定细胞凋亡表17－1Annexin法所获的细胞群分析结果四、流式细胞术在免疫学中的应用流式细胞术以其快速、准确、灵敏度高等优点，广泛应用于免疫学的理论研究和临床诊断，特别是近年来，流式细胞术与单克隆技术的结合，使流式细胞仪免疫分析克服了一般免疫学方法难以定量的不足，而得到广泛应用。流式细胞术是以单细胞或单细胞核为基础，并结合传统的免疫学方法，其基本理论是细胞上的抗原或膜受体与相关的单克隆抗体结合，形成带有荧光的抗原－抗体复合物，通过流式细胞术测定其特定的荧光量。1．T淋巴细胞及其亚群的流式细胞仪测定T淋巴细胞是机体免疫系统功能最重要的细胞群，越来越多的研究表明，T淋巴细胞亚群在很多疾病如造血系统疾病、免疫缺陷疾病、变态反应性疾病、病毒感染和恶性肿瘤等都有异常改变。用T淋巴细胞表型标志物测定人外周血CD3、CD4、CD8T淋巴细胞亚群比例和CD4/CD8比值，用于评价体内免疫调节平衡状态；测定T淋巴细胞的相对标记率，有助于研究各种与免疫有关疾病的发病机制，特别是T细胞的免疫调节功能。因此，流式细胞术可以作为临床免疫的检测手段，为临床检验提供快速、准确的重要指标。2．流式细胞术在白血病免疫分型与临床中的应用白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后呈克隆性异常增殖的结果，它的发病是多阶段的，不同病因引起的白血病其发病机制不同，利用白血病的免疫学分型能区分不同的细胞系和分化发育阶段，对光镜下不易识别的细胞能作出较为明确的诊断。由于不同分化程度的白血病细胞抗原表达不同，采用不同的单抗检测细胞表面或细胞质内的抗原，可将急性白血病分为若干类型。了解白细胞的不同分化阶段，有助于临床分型、鉴别诊断、判断预后、指导治疗。3．微量残留白血病细胞检测目前急性白血病已有许多病人经联合化疗后获得完全缓解，但部分病例仍可复发，而复发的原因是体内残存的微量白血病细胞。因而，采用不同方法在治疗前及治疗缓解后，定期检测微量残留白血病细胞，可预测早期复发，提高完全缓解质量，指导治疗。现有荧光原位杂交法，聚合酶链反应技术及免疫表型分析等方法。应用流式细胞术结合免疫表型双标记技术，先用BFA膜处理剂固定细胞，标记核TdT(终末脱氧核糖核苷转移酶)，经小牛血清封闭细胞后再标记膜特异性抗原。用T系特异性抗原CD5、CD7/TdT＋作为TALL检测指标，B系特异性抗原CD10、CD19、CD20/TdT＋作为BALL标志；髓细胞标志CD13、CD33、CDW65/TdT＋作为髓细胞白血病(AML)标志，在临床复发前4～21周可发现残留白血病细胞由阴性转为阳性，双标记阳性细胞逐渐增加。4．多药耐药性基因蛋白的检测急性白血病以及肿瘤发生耐药性是化疗导致失败或早期复发的原因之一。如何早期发现耐药细胞对选择合适的化疗方案具有参考价值。多药耐药性(multidrugresistant，MDR)是指细胞同时抵抗多种亲脂类药物。这是由于多药耐药基因1(MDR1)表达产物P170糖蛋白能使进入细胞的药物加速排出，细胞内药物浓度降低，从而失去细胞毒作用。近年来多采用MDR1单克隆抗体(MRK16、JSB1)，通过间接免疫荧光染色法进行检测MDR1mRNA是否过度表达。一旦发现有多药耐药现象，早期更换敏感药物可防治复发。5．造血干细胞移植造血干细胞移植包括骨髓、外周血干细胞及脐带血移植，是治疗急性白血病最有效的治疗方法，它常可彻底治愈，长期无病生存率高。近年来采用CD34抗原作为干细胞测量，用流式细胞仪进行CD34细胞检测，进一步检测CD34＋/CD33＋细胞，对移植后早期骨髓造血功能恢复的预测较一般的计数有核细胞数、粒－巨噬细胞系集落形成单位、CD34＋的检测更为精确。