母源性mRNA脱腺苷化和经piRNA途径衰减

Nature.Authormanuscript;availableinPMC2015July17.MaternalmRNAdeadenylationanddecaybythepiRNApathwayintheearlyDrosophilaembryoChristelROUGET1,CatherinePAPIN1,AnthonyBOUREUX2,Anne-CécileMEUNIER,BénédicteFRANCO,NicolasROBINE3,EricC.LAI3,AlainPELISSON4,andMartineSIMONELIG*mRNARegulationandDevelopment,InstituteofHumanGenetics,CNRSUPR1142,141ruedelaCardonille,34396MontpellierCedex5,France2.CRBM,UMR5237,UniversitéMontpellierII,CNRS,1919routedeMende,34293Montpellier,France3.Sloan-KetteringInstitute,DepartmentofDevelopmentalBiology,1017RockefellerResearchLaboratories,1275YorkAvenue,NewYork,NewYork10065,USA4.MechanismsandControlofRetrotransposition,InstituteofHumanGenetics,CNRSUPR1142,141ruedelaCardonille,34396MontpellierCedex5,France果蝇早期胚胎中母源性mRNA脱腺苷化和经piRNA途径衰减Piwi相关RNA（piRNA），是一种长24到30个核苷酸，由它产生的Piwi类型的ago蛋白在抑制转座子方面有特定功能。这种抑制作用被认为涉及异染色质形成、转录和转录后的基因沉默。piRNA途径还有一个基本功能：保持种系干细胞和DNA完整性。Nos作为研究母源性mRNA衰败的例子，我们发现CCR4介导的nos脱腺苷化取决于PIRNA途径的成分包括与特定nos非翻译区互补。当piRNA诱导的调控损伤时，脱腺苷化降低与胚胎里nosmRNA稳定化和翻译的去阻遏有关，导致头部发育缺陷。AUB是piRNA途径中一个ago蛋白，它在大块的胚胎里和SMG，CCR4,nosmRNA，piRNAs结合的复合物，它目标定位在3′端非编码区。我们提出piRNA和其相关蛋白与Smg一起招募CCR4脱腺苷复合物到特定mRNA上以促进其衰败。因为参与这一调控的piRNA由转座子产生，这说明转座子在基因表达调控中的直接发育功能。在果蝇胚胎里，NOS表达含量呈现出后极部梯度分布并指导腹部分节。NOSmRNA主体分布在整个细胞质中，起翻译性抑制作用，随后在发育的前2–3小时中退化。这种抑制是必不可少的头胸部分节。少量NOS转录，定位在胚后极，未降解并活跃转录，导致NOS蛋白梯度上升。NOSmRNA在细胞质的衰减取决CCR4-NOT脱腺苷化复合物并由Smg招募到NOS处。这有助于胚胎体的转录性抑制且是胚胎前后轴模式形成的要求。SMG被认为不是早期胚胎发育过程中唯一降解NOSmRNA的活化剂。在斑马鱼胚胎中合子表达的miRNA据报道激活母源性mRNA脱腺苷化和在果蝇胚胎中衰减。我们研究了其他种类的小RNA基因在mRNA脱腺苷化和合子性表达之前衰败中的潜在作用。由于piRNA是在生殖细胞中是母源性表达的并出现在早期胚胎中，我们分析了piRNA途径在母源性mRNA脱腺苷酸化作用。Piwi，Aub和Ago3是特定的ago蛋白，ARMI和SPN-E是RNA解旋酶，SQU是一种核酸酶参与piRNA的生物合成和功能。Poly(A)测试分析被用来测定在胚胎发育过程中的前四个小时每一个小时的时间间隔nosmRNA多聚A尾长度。和观察到的野生型胚胎相关NOSmRNA的poly（A）尾在这段时间内逐步缩短相反，在雌性突变体胚胎里NOS的多聚A尾缩短是受piRNA通路影响的（图1a）。这一脱腺苷化缺陷和雌性突变体胚胎里nosRNA高表达量相关，量化原位杂交显示稳定的NOSmRNA散布在突变体胚胎细胞质内，而野生型正常退化。piRNA途径在早期发育中防止DNA损伤起作用，可能是通过抑制转座子的转座。DNA双链断裂引发突变体piRNA途径而导致胚胎体轴特化受影响。这一发育缺陷被Chk2（检验点激酶2）DNA损伤信号转导途径所抑制。我们发现nosmRNA在脱腺苷化方面的缺陷和在aub和armi突变体里观察到的衰变不会被Chk2突变抑制，这表明这些缺陷并不是由发育过程中Chk2途径过早激活造成的。而且，影响实验动物NOSmRNA在piRNA途径的突变，并不取决于oskar基因。我们提出piRNA途径在调控胚胎里mRNA脱腺苷化和衰败中有潜在的直接作用。aub和Piwi蛋白积聚在极质和胚胎的极细胞。但是我们发现低含量的AuB和PIWI蛋白遍及整个细胞（图2a）。Ago3也充满整个胚胎。Aub和Ago3在胞质的并在分离中心积累,分布类似CCR4和SMG.CCR4和Smg据报道部分定位于小的细胞质中心。.Aub和Ago3也和Smg、CCR4一起定位于大部分的合胞体胚胎中的细胞质分离中心和一个广泛分布的胞质池。很重要的一点，CCR4和Smg的分布取决于piRNA通路,它们强烈影响aub和spn-E突变体胚胎。尽管突变体胚胎中CCR4和Smg的总量并没有减少,CCR4强烈增加,而Smg减少或消失。这表明CCR4亚单位和Smg的不同功能,其脱腺苷化在细胞质中广泛发生。这些结果表明CCR4介导的脱腺苷化和piRNA途径之间有功能方面的联系。免疫共沉淀实验显示在缺乏RNA时，Aub共沉淀Smg,CCR4和Ago3说明这些蛋白以复合体的形式存在。Smg也会共沉淀CCR4，Aub和Ago3。但是，并未发现Piwi共沉淀Smg或CCR4。重要的一点，在osk54极质组装缺陷的突变体胚胎里Smg,CCR4和Ago3共沉淀Aub，这一现象表明此复合体出现在极质外面。我们接着展示了在野生型和osk54胚胎里nosmRNA和Aub共沉淀。NosmRNA的量在Aub和Smg的免疫沉淀反应是相似。这些发现表明ago蛋白家族中的Aub、Ago3结合Smg,CCR4脱腺苷化复合物直接调控早期胚胎细胞质中的nosmRNA。Nos3′的非编码区包含了Smg的结合位点。我们用敲除3′端非编码区不同部分的nos染色体组上的基因满足nosmRNA脱腺苷化相应区域的要求。我们以前证明：TCE(nt1–184)是nosmRNApoly(A)尾缩短过程所需的，和Smg在这一过程中的作用一致。敲除184–403这部分没有影响，但是3–4小时胚胎里敲除403–618这部分会使poly(A)尾延长。敲除nos3′端非编码区的618–844序列对nos的脱腺苷化有强烈影响。为了进一步证明逆转录转座子在nosmRNA调节中的作用，我们阻断412和roopiRNA，roopiRNA在胚胎里被注入特定2′O-甲基化的抗piRNA。抗RNA的注入或抗RNA（roo）导致特定头部发育缺陷。同时，这些结果强大地证明了在胚胎发育的前几个小时nosmRNA脱腺苷化需要piRNAs和nosmRNA之间的相互作用。我们已经鉴定了piRNA途径在母源性mRNA调控中的新功能。最近，源自细胞转录物3′非编码区的piRNA已经在性腺体细胞中被鉴定出来，尽管它们的生物学作用还没被明确。在此，我们提出piRNA和piwiago蛋白中的Aub和Ago3形成复合物定位到母源nosmRNA并招募Smg与脱腺苷化的CCR4-NOT形成的复合物。这些相互作用引起mRNA迅速脱腺苷化和衰减。因此mRNA脱腺苷化的激活作用表现了，在胚胎发育第一步中，piRNA途径作为一种必需功能的直接机制。Smg作为胚胎早期发育中mRNA衰减的一般因素。早期胚胎里，Aub和Ago3与Smg以复合物的形式出现。SmgmRNA靶点的比例可以被piRNA途径调控。与此一致，其他母源物质在早期胚胎发育中是不稳定的，这些物质被大量的piRNA作为靶位点且它们的脱腺苷化取决于piRNA途径。参与基因调控的这些piRNA产生于转座子序列。尽管转座子被认为是基因组动态变化与演变所必需的，它们在组织里的直接作用仍然相当难以捉摸。这一研究为转座子和宿主细胞基因组之间的相互作用提供了证据并显示了转座子通过基因抑制在胚胎图式中的直接发育功能。