氨基酸分析

生物化学实验报告姓名：XXX学号：XXXXXXXXXX专业年级：XXXXXXXXXXX组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称氨基酸的薄层层析实验日期2016-10-25实验地点第二实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1、掌握薄层层析法的一般原理。2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。3、掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。二、实验原理1.薄层层析法是色谱分析技术的一种。一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）硅胶吸附薄层层析：吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。硅胶吸附薄层层析的特点：①硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。②硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。③硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。2.氨基酸与茚三酮的显色反应茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rateofflow）来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。即：Rf=原点到层析斑点中心的距离原点到斑点对应前沿的距离由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。三、材料与方法：1.实验材料（1）材料：分析样品（氨基酸混合液）、吸附剂（硅胶）、粘合剂（0.5%的羧甲基纤维素钠）、氨基酸的异丙醇溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸）、展开-显色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液）；（2）器材：层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻棒、量筒、吹风机、毛细管、层析缸、药匙、烘箱。2.实验步骤（1）实验流程：制板点样层析显色数据处理与结果分析（2）操作步骤：①薄层板的制备：调浆：称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。干燥：将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。活化：70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。②点样：标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。每个样品间相距约1cm。取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高5cm。点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样（轻触疾起）。加样后原点扩散直径不超过2mm。③层析：将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄层板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界限。④显色：用热风吹干或在90℃下烘干30分钟，即可显出各层斑点。四、结果与讨论：1.结果：（1）数据处理：样品斑点-原点溶剂前缘-原点Rf值Ala3.205.900.542Gly2.605.900.441Arg1.505.900.254混合点11.505.900.254混合点22.605.900.441混合点33.105.900.525（注：单位为cm）（2）实验现象：①点样后的斑点直径大小适中，不超过0.2cm。②层析时，浸入展层-显色剂中的薄层板放得比较正，且展层-显色剂液面低于点样线，在层析约40min后溶剂前缘达层析板的1/2处，取出并用铅笔描出溶剂前沿界线，溶剂前沿是一条较平整的水平线。③在利用烤箱烘干后，层析板上出现6个蓝紫色斑点，其中两个斑点靠得比较近。（3）实验结果图：丙氨酸甘氨酸精氨酸混合液321溶剂前沿2.讨论：（1）实验误差分析：混合点3的Rf=0.525≠0.542（测定的标准值）。原因可能有：①在整个实验过程中，层析板的制作是基础，硅胶分布的均匀与否直接影响了实际的实验。而从溶剂前沿并不完全水平（玻璃片右下角有缺口）可以知道，实验所用的层析板质量不是很好，一定程度上影响了实验的数据测定，导致实验的误差。②在判定斑点中心和测量距离时，存在一定的人为误差，导致了结果上的不一致性，但影响较小。③操作过程中存在一定的误差，如层析时间不足等都有可能导致。（2）注意事项：①切勿用手直接接触薄层板面。②点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。③样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。（3）结论：根据计算所得的数据，可见混合点1的Rf（0.254）值等于精氨酸的Rf值（0.254），混合点2的Rf值（0.441）等于甘氨酸的Rf值（0.441），混合点3的Rf值（0.525）接近于丙氨酸的Rf值（0.542）。由实验原理可得，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展层-显色剂中的溶解度不一样，点在薄层板上的混合氨基酸样品随着展层-显色剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。所以每一种氨基酸所对应的Rf值应是唯一的。所以我们可以得出如下结论：在一定误差允许的范围内，混合点1所对应的氨基酸为精氨酸，混合点2所对应的氨基酸为甘氨酸，混合点3所对应的氨基酸为丙氨酸。最终可以得到结果：混合的氨基酸溶液中，存在有丙氨酸、甘氨酸和精氨酸三种氨基酸。3.思考题：（1）硅胶的吸附力与含水量的问题：答：硅胶属于极性吸附剂，它的活性可分为5个等级，活性等级越大，硅胶的吸附性能越小。该活性与水的含量有关。硅胶活性级别与含水量关系：Ⅰ:0%;Ⅱ:5%;Ⅲ:15%;Ⅳ:25%;Ⅴ:38。即：吸附力越大，含水量越少（硅胶的吸附能力与含水量呈负相关）。（2）吸附实验中吸附剂的选择根据：答：①吸附剂应该具有最大的表面积和吸附力。②吸附剂对不同的物质有不同的吸附作用。③吸附剂不能与溶剂和样品发生化学反应。④吸附剂应均匀，且不能在操作中被损坏。（3）氨基酸纸层析，两者有何区别：答：①吸附剂不同：薄层层析使用硅胶,纸层析使用纸张。②速度不同：薄层层析比纸层析更加的快。③分辨率不同：薄层层析具有的分辨率比纸层析高。