氨基酸聚酰胺薄膜层析

氨基酸聚酰胺薄膜层析——DNS-Cl法一、实验目的：1．掌握聚酰胺薄膜层析技术的基本方法和应用。2．熟悉蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS分析法。二、实验原理：.1.层析技术①概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。②特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。③层析法的分类气相层析（以气体为流动相的层析法）液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法）I.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析II.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析III.离子交换层析IV.凝胶层析：柱层析、薄膜层析V.亲和层析④纸层析法(paperchromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方法，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf=原点到层析斑点的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。2.荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-C1)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-蛋白质再经酸水解可释放出DNS-氨基酸。DNS-C1能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。DNS-氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除DNS-色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS-氨基酸很少破坏。故DNS法可用于蛋白质和肽的氨基酸组成N末端分析。DNS-C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，层层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。三、实验用品：1.实验器材聚酰胺薄膜（7cm×7cm）、小钟罩、吹风机、小离心管、毛细管、紫外分析仪、小培养皿、移液枪2.实验试剂PH9.9的标准赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨基酸，混合氨基酸、展层液（以甲酸：水==1.5:100配制）四、操作方法：1.DNS-Cl标记PH9.9的标准氨基酸取4个小离心管，分别加入三种标准氨基酸以及混合氨基酸各30微升，在各加入30微升DNS-Cl丙酮溶液，充分混合（避光）。然后将4个离心管在37度水浴中保温1h。2.点样在距边1cm处画一基线，在上面每隔1cm画—点作为点样位置。用毛细管取样，点在聚酰胺薄膜点样位置上，点子直径不得超过2mm，若需要多次点样时，应当将第一次样品点吹干后，再点第二次。3.展层将点完样的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向内，箍以橡胶圈。层层容器用烧杯套住，内放一小培养皿，倒入5-10mL展层溶剂进行展层，以溶剂前沿走到距边约0.3cm为度(约10～20分钟)，取出薄片，然后用吹风机吹干。4.透射将聚酰胺薄膜至于紫外分析仪中，观察荧光斑点五、实验结果：图1实验结果图谱（铅笔勾线）（）由原理可知，当DNS-Cl过多时，会产生DNS-NH2，后者在紫外光照射下呈现蓝色荧光。由此可解释每组中的蓝色荧光斑点现象。而赖氨酸与DNS-Cl反应生成DNS--赖氨酸的同时也生成了DNS-双-赖氨酸，所以赖氨酸组中有两个黄绿色荧光斑点，一个为点状，另一个呈V字形。丙氨酸中只有一个四边形黄绿色荧光点，苯丙氨基酸也只有一个不规则黄绿色荧光点。而混合样品中有三个不规则黄绿色荧光点以及一个V字形黄绿色荧光点，可知它含有三种氨基酸。原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离Rf丙氨酸10530.189苯丙氨酸26550.473赖氨酸7550.127成分16540.111成分29540.167成分329540.537成分1：赖氨酸成分2：丙氨酸成分3：苯丙氨酸从左到右丙氨酸，混合氨基酸，苯丙氨酸，赖氨酸，混合氨基酸有丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸。六、注意事项：1.在实验操作中应注意不要污染聚酰胺薄膜。用手拿层析薄膜时不能接触无光泽一面，不嫩使其沾水，以防污染薄膜，造成实验结果不精确。2.向离心管中加入氨基酸及样品前贴好标签，以防加混试剂。3.两次点样间要吹干。4.不要让点样管与薄膜过久接触，否则氨基酸溶液扩散使荧光斑点不标准。5.展层时勿将原点浸入溶剂系统，层折薄膜在小培养皿中须保持直立状态。薄膜应卷曲呈圆柱状而非漏斗状，因为样品可能由于此原因造成层析交叉影响实验结果的观察。6.点样点的直径不能大于0.5cm，否则分离效果不好，并且样品用量大，会造成“拖尾巴”现象。七、思考题：1.纸层析法的原理是什么？纸层析法又称纸色谱法。以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析。2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素和注意事项？Rf=原点到层析斑点的距离/原点到溶剂前沿的距离Rf值是指溶质在滤纸上的移动速率。影响Rf值的主要因素是溶质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素。只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，溶质的Rf值是常数。3.实验中出现了拖尾的现象？拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。图象的出现，是在实验中对影响Rf值的主要因素要求，掌握不够所致。诸如，物质结构与极性对Rf值的影响，层析溶剂对Rf值的影响，PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值)，温度对Rf值的影响，滤纸的质地是否均匀，薄厚是否适当，纤维的松紧度是否适中等对Rf值的影响，展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响。然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。此时，这就需要从具体操作规范方面，诸如样品的处理，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索，经仔细分析，样品的处理是为除去杂质纯化样品，达到层析分配某氨基酸的情晰显色图像；展层过程是在上述影响Rf值的主要因素要求下进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上，区分不同样品的氨基酸；显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥发性较快喷雾后迅速吹干的。更何况显色剂又是含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液，和为了对照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，或血球计数器将5一j5微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。点样后要自然风干，或冷风吹干。最好不要用加热装置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。因为加热装置在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高势必要使样品破坏，更会使佯品点干的太燥。正是由于这样，样品点太干燥，使其样品物的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。所以在展层过程中，样品点的每个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时都集中到达一个位置。致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。纸上分配层析所出现的拖尾现象，究其原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。样品点不要吹的太干燥，否则，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。4.展层剂的选择依据？展开剂的选择条件：①对的所需成分有良好的溶解性；②可使成分间分开；③待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间；④不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，黏度较小；⑥展开后组分斑点圆且集中；⑦混合溶剂最好用新鲜配制。一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离；中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离；强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。