淀粉酶的分离纯化(上)浸提盐析透析浓缩

淀粉酶的分离与纯化（上）浸提、盐析、透析、浓缩一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的一般程序。2、掌握盐析、透析、浓缩的基本原理与操作。二、实验原理蛋白质作为溶液稳定存在的两大因素：1.蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出；2.蛋白质颗粒表面可带相同电荷颗粒之间相互排斥不易聚集沉淀，也可以起稳定颗粒的作用。若去除蛋白质颗粒这两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀。盐析是一种与蛋白质的沉淀的性质相关的分离方法：它用硫酸铵、硫酸钠等中性盐来破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素，故能使蛋白质发生沉淀。不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，故盐析所需要的盐浓度不同，从而将蛋白质分离。如用硫酸铵分离清蛋白和球蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液中，球蛋白即可从混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在饱和硫酸铵中才会沉淀。盐析的优点是不会使蛋白质发生变性。三、仪器与试剂1、缓冲液：0.05M磷酸氢钠缓冲液（PH7.0），含5mmol/l2-巯基乙醇，1mmol/lEDTA,0.5mmol/l，PMSF。2、仪器：离心机，量筒，研钵，四、实验内容（一）浸提采用缓冲液从固态粗酶粉中浸提粗酶液。称取粗酶粉2.5g，加入20ml缓冲液，研磨5-10min，3500rpm离心分离10min，收集上清液。为提高收率，沉渣可加入适量缓冲液再浸提1~2次，离心，合并上清液，即为粗酶液，测定体积。测定粗酶液的酶活力，计算总酶活1(酶活力×体积)（二）分级盐析根据粗酶液体积，计算出达到相应饱和度需要加入的硫酸铵的量。慢慢的向粗酶液中加入硫酸铵至30%饱和度，静置20min后，在12000rpm的转速下离心20min，分别收集上清液与沉淀A。测量上清液体积，再慢慢向上清液中加入硫酸铵至70%饱和度，静置20min后，在12000rpm的转速下离心20min，分别收集上清液与沉淀B。按同样的方法再次调节硫酸铵饱和度100%，静置20min后，在12000rpm的转速下离心20min，分别收集上清液与沉淀C。收集每一饱和度下沉淀出的蛋白质（沉淀A,B,C），分别用5ml的缓冲液溶解.测定组分A,B,C的酶活力和蛋白质浓度，以确定淀粉酶主要存在于哪一级的沉淀中，并计算组分B的收率。如果需要，可将采用更细的分级。组分B的收率=（B的酶活力×B的体积）/总酶活1×100%（三）透析1、透析袋的预处理：透析袋的处理主要是除去污染物，特别是重金属和蛋白酶等对蛋白质有毒害作用的物质。可在0.1mol/l的EDTA溶液中煮30min，再换用蒸馏水煮7次，每次20分钟。2、透析：将所收集的具有酶活力的组分（组分B），放入透析袋，置于清水中，电磁搅拌，透析24h，中间换水3-4次。为了防止酶失活，整个透析系统应低温放置。铵离子是否除尽采用纳氏试剂检测。（四）浓缩透析后，透析袋中液体浓度低，体积较大，可用蔗糖或PEG6000包埋浓缩至1-1.5ml。取出0.5ml测定酶活力，其余的置于冰箱中备下次实验使用。计算酶活力的收率。附录:调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）