混饲恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响

混饲：恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响2008级动物医学（2）班王亚指导老师孙素玲（教授）摘要目的：研究恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响。方法：40只小鼠随机分为5组，公母各半；组Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ为试验组。每天分别饲喂剂量为50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg和200mg/kg的氧氟沙星，组Ⅰ为对照组，每天饲喂相同饲料，每天饲喂前禁食4h，后6h开始给食，持续饲喂四周，各组自由饮水。采用钙沉淀法制备小鼠肝微粒体，用测定代谢生成的对-氨基酚量的方法来测定苯胺羟化酶的活力。结果四个试验组的苯胺羟化酶的活力分别为190.459±47.406nmol/（mg.min）、131.827±53.320nmol/（mg.min）、32.196±10.705nmol/（mg.min），对照组为419.404±198.971nmol/（mg.min）。与对照组相比，4个试验组苯胺羟化酶的活力都显著下降（P＜0.01），且随着剂量的增大而活力下降。结论：恩诺沙星在50mg/kg—200mg/kg范围内能降低苯胺羟化酶的活性。关键词氧氟沙星；肝微粒体；苯胺羟化酶恩诺沙星(C19H22FN3O3)又名乙基环丙沙星,是第一个动物专用的氟喹诺酮类抗菌药物,1987年由德国拜耳公司首创投放市场,我国在1992年由广东海康兽药厂研制成功,其具有杀菌活性强、抗菌谱广、生物利用度高、毒副作用小等优点[1]。研究恩诺沙星的稳定性,对于保证药物的安全有效、提高药剂疗效、减少给药次数、延长贮存期以及实际生产和药剂用量有重要作用[2]。陆英杰等研究出恩诺沙星在短期内对实验小鼠免疫细胞有影响,尤其是T淋巴细胞[3]。孙素玲、程玲玲等研究钼酸胺口服剂量在8.325mg/kg~66.6mg/kg范围内能使大鼠苯胺羟化酶的活力增强[4]。曾五和(2002)等[5]、罗雅劲(2010)等[6]对恩诺沙星不同剂型在猪体内的药动学及生物利用度进行研究，结果显示，恩诺沙星剂型不同，在体内吸收、达峰时间及消除半衰期时间存在差异。余建娣等按磺胺间甲氧嘧啶-恩诺沙星2ml(含磺胺间甲氧嘧啶0.1g,恩诺沙星0.05g)试验剂量对20只大白鼠进行腹腔注射,常规饲养8d未见任何动物死亡,故大白鼠对磺胺间甲氧嘧啶-恩诺沙星的最大耐受剂量(MTD)0.5g/kgBW(以磺胺间甲氧嘧啶计)。即MTD大于规定使用剂量25倍以上,休药期应考虑在28d以上[7]。关于恩诺沙星的研究目前国内只限于对微生态方法,关于恩诺沙星对机体的毒性作用，肝脏苯胺羟化酶活性的影响报道甚少,为此本试验通过对实验小鼠肝脏苯胺羟化酶活性影响的动态观察，为评价不同剂量的恩诺沙星对人和动物生物酶活性的影响，钒的安全评价等提供参考。1材料1.1动物的选择和处理小白鼠40只，体重20—23g，安徽科技学院实验动物中心提供。观察饲养两周。1.2主要试剂恩诺沙星：分析纯，合肥工业大学试剂厂，批号为030516；0.9%氯化钠溶液：安徽环球药业股份有限公司，批号为041025—2；蔗糖：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为H20041215；三羟甲基氨基甲烷：分析纯，北京化学试剂公司，批号为031009；氯化钾：化学纯，中国上海试剂一厂，批号为04—06—57；氯化钙：分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司，批号为F20040628；氯化氢溶液：分析纯，上海东懿化学试剂公司，批号为20030910；过氧化羟基异丙苯：化学纯CP，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为T20040110；盐酸苯胺：分析纯AR，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为W20031020；三氯乙酸：分析纯，上海化学试剂采购供应站经销，批号为030114；无水碳酸钠：化学纯，山东博山试剂厂，批号为030508；氢氧化钠：分析纯，宜兴市第二化学试剂厂，批号为030401；苯酚溶液：分析纯AR，上海兴达试剂厂出品，批号为040301；对-氨基酚：化学纯CP，国药集团化学试剂有限公司，批号为F20040816；硫酸铜：化学纯，合肥工业大学化工厂，批号为040214。1.3主要仪器FA1004N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；YP600型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；TDL80—2B型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；TGL—16C型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；DY89—I型电动玻璃匀浆机，宁波新芝科器研究所；THZ—C恒温震荡器，太仓市光明分析仪器厂；HH—S恒温水浴锅，江苏国胜实验仪器厂；BCD—502F型冰箱，青岛海尔冰箱股份有限公司；721型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；1.4药液的配制蔗糖—Tris—Hcl缓冲液（PH7.4）称取蔗糖85.6g，三羟甲基氨基甲烷1.2g，溶解于约800ml蒸馏水中，用盐酸调PH到7.4最后再用蒸馏水定容至1000ml，放置于冰箱中保存备用。Kcl-Tris-Hcl缓冲液（PH7.4）称取氯化钾11.2g，三羟甲基氨基甲烷1.21g，溶解于约800ml蒸馏水中，用盐酸调PH到7.4最后再，用蒸馏水定容至l00ml，放置于冰箱中保存备用。氯化钙（Cacl2）溶液称取氯化钙5.0g，用蒸馏水定容至100ml。0.1mol/L的Tris—Hcl缓冲液（PH7.4）称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加约80ml蒸馏水溶液，用盐酸调PH到7.4最后再用蒸馏水定容至100ml，放置于冰箱中保存备用。过氧化羟基异丙苯溶液称取过氧化羟基异丙苯0.65g，用蒸馏水定容至l00ml。盐酸苯胺溶液称取1029g盐酸苯胺，用蒸馏水定容至l00ml。70%三氯乙酸溶液称取三氯乙酸70g，用蒸馏水稀释至100ml。碳酸钠溶液（Na2CO3）溶液称取10.6g，无水碳酸钠用蒸馏水溶解并稀释100ml。氢氧化钠（NaOH）溶液称取氢氧化钠4g，用蒸馏水溶解并稀释200ml。酚试剂量取苯酚溶液2ml，加NaOH溶液至100ml。0.25mol.L-1对-氨基酚标准溶液精确称取27.28mg对-氨基酚，用少量的蒸馏溶解后转移入1000ml容量瓶中加水定容至1000ml。2方法2.1实验动物的分组和染毒方式40只小鼠随机分为5组，公母各半；组Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ为试验组。每天分别饲喂剂量为50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg和200mg/kg的氧氟沙星，组Ⅰ为对照组，每天饲喂相同饲料，每天饲喂前禁食4h，后6h开始给食，持续饲喂四周，各组自由饮水。各组的饲养管理条件相同。实验期间细心观察各组小鼠的情况。2.2样本的采集和处理2.2.1小鼠肝微粒体的制备（钙沉淀法）将小鼠停食24h后，颈椎脱臼处死，，迅速剖开腹腔取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，并用滤纸吸干表面的水分。将肝脏称重后置于烧杯中，用手术直剪剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入蔗糖—Tris—Hcl缓冲液，用电动玻璃匀浆机匀浆，转速600r/min分，研磨上下移动8次。将匀浆倒入量筒，用缓冲液洗涤匀浆管并将其倒入量筒中，最后缓冲液的体积加至约5ml/g组织。将肝匀浆转移到离心管中，以600r/min平衡离心5min，弃取沉淀部分（细胞碎片和细胞核），上清液以12000r/min离心10min，弃取沉淀部分（线粒体）。量取去除线粒体的上清液的总体积，加入Cacl2溶液2ml，以14000r/min离心15min，弃取上清液，沉淀部分即为粉红色，半透明的微粒体。将微粒体沉淀，混悬于Kcl-Tris-Hcl缓冲液中，并用玻璃匀浆器充分混均匀，再经14000r/min离心15min，其沉淀即为经清洗的微粒体。最后将制备所获得微粒体悬混于Kcl-Tris-Hcl缓冲液（缓冲液用量约为1ml/g组织）中，用玻璃匀浆器充分混均匀，并分装后放置于冰箱中保存。使用前按双缩脲法测定微粒体蛋白的含量。2.2.2微粒体蛋白含量的测定（双缩脲法）[8]取6只试管，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准酪蛋白质溶液，再分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0毫升蒸馏水，然后加入1.0毫升双缩脲试剂在室温放置30min，于540毫微米波长下比色，最后光密度以Y表示，酪蛋白的含量以X表示，计算出曲线的回归方程一。吸取1毫升微粒体混悬液，加入1.0毫升的蒸馏水和4.0毫升双缩脲试剂，与前同样比色，根据吸光度和回归方程一求出微粒体混悬液蛋白的含量。2.2.3苯胺羟化酶的活力的测定[9.10]取清洁干燥的试管按表1加入试剂,将上述各试管置于37℃水浴预温3min后，按顺序每管加入过氧化羟基异丙苯0.1ml，继续水浴震荡3min，按顺序每管加入三氯乙酸溶液0.3ml，微粒体悬混液0.5ml。经2000r/min离心10min后，分别将各管的全部上清液取于另一试管中，加入1ml酚试剂，室温下反应30min。以1号试管作参比，在630nm处比色测定，以吸光度为Y，对-氨基酚的含量为X，算出回归方程二。表1标准液的配制试管编号缓冲液（ml）对-氨基酚标准液（ml）相当于对-氨基酚（nmol）1234567891.51.41.31.21.11.00.90.70.500.10.20.30.40.50.60.81.00255075100125150200250取清洁干燥的试管按表2加入试剂：表2：样品测定液的配制空白对照管（ml）样品测定管（ml）微粒体缓冲液苯胺溶液蒸馏水0.51.4—0.10.51.40.1—以下的操作除不再加微粒体外，其余步骤与标准曲线操作相同。以空白管作为参比，测样品管测的光密度值，依据回归方程二求出对应的对-氨基酚含量（nmol），并按下式计算苯胺羟化酶的活力。苯胺羟化酶的活力（nmol/mg.min）=生成的对-氨基酚含量（nmol）/微粒体蛋白浓度（mg/ml）×0.5×32.3统计方法用SPSS11.0forwindows软件对试验数据的进行统计分析,试验数据以()表示,确定差异显著性作t检验,以P0·05为差异具有统计学意义。3结果与分析3.1回归方程一根据表3所测的数据计算出回归方程一为Y=0.065+1.76X,r=0.9908根据回归方程一计算出的蛋白质的含量,见附录。根据表4的数据[14]求出的回归方程二:Y=0.021+2.858×10–3X,r=0.9802根据回归方程二计算出对-氨基酚的含量，见附录。根据公式：苯胺羟化酶活力（nmol/mg.min）=生成对氨基酚的含量/微粒体蛋白浓度，计算出苯胺羟化酶活力见表5。表3：标准蛋白质溶液的吸光度试管编号相当于蛋白质（mg/ml）吸光度123456024681000.0570.1950.2660.4700.5573.2回归方程二表4：标准液的吸光度试管编号相当于对-氨基酚（nmol）吸光度123456789025507510012515020025000.0690.1590.1980.3020.4240.5300.5940.681表5恩诺沙星对苯胺羟化酶活力影响(，n=5)组别染毒剂量苯胺羟化酶的活力（nmol/mg.min）ⅠⅡⅢⅣⅤ050mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg419.404±198.971190.459±47.406131.827±53.32082.260±19.25932.196±10.705注：与对照组比较，**p0.01*p0.05对照组Ⅰ苯胺羟化酶的活力419.404±198.97nmol/（mg.min），实验组Ⅱ苯胺羌化酶的活力为190.459±47.406nmol/（mg.min），实验组Ⅲ苯胺羌化酶的活力为131.827±53.320nmol/（mg.min），实验组Ⅳ苯胺羌化酶的活力为82.260±19.259nmol/（mg.min），实验组Ⅴ苯胺羌化酶的活力为32.196±10.705nmol/（mg.min），与对照组相比，四个实验组差异都极显著（P﹤0.01），并且随着偏钒酸铵剂量的增加苯胺羟化酶的活力逐渐下降,而实验组之间相对比实验组Ⅱ与实验组Ⅴ差异极显著,实验组Ⅱ与实验组Ⅳ差