柠檬酸发酵工艺.

第一章柠檬酸发酵工艺学柠檬酸合成途径葡萄糖丙酮酸柠檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EMP途径氧化脱羧羧化淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸CO2CO2CO2NH4+PiK+AMPATP三羧酸循环与乙醛酸循环有关的细胞内的反应脂质体乙醛酸循环体线粒体胞浆糖异生琥珀酸2.1概述2.2黑曲霉柠檬酸生产菌的选育及保藏2.3柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺2.4柠檬酸的提取和精制2.5柠檬酸的质量标准及新工艺新技术柠檬酸深层发酵工艺流程2.4.1柠檬酸提取工艺钙盐离子交换法提取精制柠檬酸工艺流程1.发酵醪预处理发酵醪成分如下：柠檬酸80％～95％，葡萄糖酸0.2％～0.3％，草酸0.1％～0.3％，残糖0.2％～0.5％。此外还含有蛋白质等胶体物质。在发酵结束之后，应及时将发酵液加热至90℃。热处理的作用：（1）杀死微生物终止发酵，防止柠檬酸被分解（2）使蛋白质等胶体物质变性凝固，降低发酵液粘度，有利于过滤；（3）使菌体内柠檬酸释放出来，提高收率。2.菌丝过滤3.中和4.酸解脱色5.树脂净化强酸型阳离子交换树脂去除Ca2＋、Fe3＋等金属离子。6.浓缩与结晶将酸解液置于60℃以下进行减压蒸发，浓缩至70％以上，待结晶。7.干燥沸腾干燥箱，去除晶体表面的自由水。温度控制在35℃以下，否则会失去一部分结晶水，影响成品光泽。钙盐法提取工艺流程简图柠檬酸提取方法从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有以下几种：钙盐法、萃取法、离子交换吸附法、电渗析法、超滤膜法。但目前普遍使用的仍是钙盐加离子交换的提取方法。柠檬酸发酵液成分复杂，并且因原料和发酵工艺不同而各不相同。除柠檬酸外，还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有机杂酸、无机盐等多种杂质，总的来说，它们来源于原材料、未消耗的营养盐或发酵的中间副产物。所以从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸是比较困难的。2.4.1.1发酵醪的预处理(1)发酵醪的组分:固形物90~180g/L（薯干粉原料发酵醪固形物﹥200g/L）；柠檬酸100~150g/L，草酸2~3g/L，葡萄糖酸2~3g/L，其它杂酸3~4g/L；残糖2~5g/L（糖蜜发酵残糖较多，约10~20g/L）；蛋白质3~5g/L。石油发酵中，异柠檬酸300~480g/L。(2)柠檬酸成熟发酵醪呈黄褐色至深褐色（高温下长时间灭菌会使颜色变深）(3)发酵液预处理的方法和原理将新鲜成熟发酵醪升温至80~90℃，不停的搅拌，时间不宜长。热处理作用：1）及时热处理可杀死柠檬酸生产菌和杂菌终止发酵，防止柠檬酸被代谢分解；2）使蛋白质等胶体物质变性而絮凝，降低发酵液粘度，有利于过滤；3）可使菌体中的柠檬酸释放出来，提高收率。但升温过高，使菌体细胞破裂会释放出较多杂质。预处理的技术要点：1）加热温度不宜过高，加热时间不宜过长，会使菌体破裂而自溶，释放出蛋白质，反而使料液粘度增加，颜色变褐，不利于净化。2）不宜过长时间直接蒸汽加热，会增加料液稀释度，有损于收率，最好采用热交换器的间歇加热。钙盐离子交换法提取精制柠檬酸工艺流程2.4.1.2发酵醪过滤发酵液的过滤是柠檬酸提取工艺中第一步除杂操作。采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。过滤的目标：彻底去除发酵醪中的悬浮物（1）过滤原理利用一种很多毛细孔的过滤介质，以过滤介质两侧的压力差为推动力，使柠檬酸发酵醪的液体通过小孔，而得到澄清的滤液，而菌体、纤维等残渣悬浮物被截留并积累在介质表面而形成滤饼。滤液要通过介质，要克服介质对流体的阻力，其阻力为介质和滤饼产生的阻力之和，而起主要作用的则是滤饼的厚度和特性。滤饼厚度随过滤时间的进行而增加。过滤特性取决于滤饼的可压缩性和不可压缩性。可压缩性滤饼为无定型的颗粒组成，粒与粒之间的孔道随压缩的增加而变小，因此对滤液的流动产生阻力，柠檬酸发酵液的颗粒形成的滤饼属此类型。不可压缩性滤饼为不变形颗粒组成，当它沉淀于介质上时，多颗粒之间相互排列的孔量和粒与粒之间的孔道均不受压强的增加而改变，中和生成的柠檬酸钙和酸解过程中生成的硫酸钙形成的滤饼属于此种滤饼。（2）工业过滤主要设备（板框式过滤机）过滤机、加热桶、泵、贮罐等。柠檬酸pH低，过滤温度85℃，选用不锈钢板框。（3）过滤操作技术要点：滤饼的厚度达到一定程度时，才变成真正的过滤介质，在开始过滤时，流速不宜过大，否则细小颗粒易穿过介质空隙而未被截留，只有当介质表面有滤饼时，滤液才变清；若形成不了滤饼介质层，则会出现浑浊滤液。平均过滤速度（4）过滤液质量主要参数1）一次滤液一水柠檬酸≥9.0g/dL，悬浮物≤0.1g/dL。2）滤饼含水量≤55%～70%，一水柠檬酸≤2.5%。3）复滤液一水柠檬酸≥9.0g/dL，悬浮物≤5mg/L。（5）发酵液过滤特性的改变微生物发酵液的特性①发酵产物浓度较低，大多为1%~10%，悬浮液中大部分是水；②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；③固体粒子可压缩性大；④液相粘度大，大多为非牛顿型流体；⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物。（6）改善发酵液过滤特性的物理化学方法调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。方法：1.降低液体粘度2.调整pH3.凝聚与絮凝4.加入助滤剂5.加入反应剂1.降低液体粘度根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，通过加水稀释或加热等方法降低液体粘度。稀释或者加热可以降低发酵液黏度，有利于输送和过滤等后续操作。单从过滤操作看，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效地提高过滤速率。注意加热温度与时间，不能影响产物活性和细胞的完整性。2.调整pH3.凝聚与絮凝pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。溶液pH值的变化会影响离子型絮凝剂中官能团的电离度，从而影响分子链的伸展状态。电离度增大，由于链节上相邻基团的电排斥作用，使分子链从卷曲到伸展，所以架桥能力提高。采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。胶体结构——胶体粒子是由许多分子所聚集而成的，分子与分子之间会存在空隙，所以溶液中的部分离子就会进入到胶核，然后再吸附少量的带相反电荷的离子，总的来说，胶体的电性是首先进入到胶核的离子的电性（胶粒），由于胶粒带电，在吸附一部分异种电荷离子，形成胶团。胶体能稳定存在是因为胶体粒子带相同电荷，互相排斥，从而使胶体粒子不会结合在一起而发生沉淀，当加入电解质时，加入了与胶体粒子相反电荷的离子，使胶体电性中和，于是发生聚沉。加入的电解质所带电荷越多，离子半径越小，就越容易使得胶体粒子聚沉。絮凝——在胶体或悬浮体内加入极少量的可溶性高分子化合物，使水或液体中悬浮微粒集聚变大，或形成絮团，从而加快粒子的聚沉，达到固-液分离的目的。凝聚——指在电解质作用下，胶体和分散系双电层压缩、ζ电位破坏、电性中和而脱稳，并聚集为絮状颗粒的过程。凝聚过程就是胶粒聚集成较大颗粒的过程。聚沉——胶体的微粒在一定条件下发生聚集的现象。向胶体中加入盐时，其中的阳离子或阴离子能中和分散质微粒所带的电荷，从而使分散质聚集成较大的微粒，在重力作用下形成沉淀析出。这种胶体形成沉淀析出的现象称为胶体的聚沉。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；氯化铝AlCl3•6H2O;三氯化铁FeCl3;硫酸亚铁FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3（1）凝聚发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如---COOH）或阳离子（如---NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。高分子絮凝作用是吸附了溶胶粒子以后，由于高分子化合物本身的链段旋转和运动，将固体粒子聚集在一起而产生沉淀。（2）絮凝1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。目前最常见的高分子聚合物絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：①非离子型②阴离子型（含有羧基）③阳离子型（含有胺基）工业上使用的絮凝剂可分为三类：聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快，种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点存在一定的毒性（微毒），特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。美容小贴士很多护肤品中都含有聚丙烯酰胺，因其为凝胶状聚合物，可调整护肤品的质地。聚丙烯酰胺是化妆品中经常用到的原料之一，可用做泡沫稳定剂、增稠剂、成膜剂、抗静电剂和头发定型剂等。因为聚丙烯酰胺是丙烯酰胺+双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成，所以聚丙烯酰胺中不可避免地会带有微量丙烯酰胺的单体残留物，可能会出现在化妆品成品中。两种单体都是可经皮吸收的有毒物质，化妆品中存在5ppm以下的丙烯酰胺残留是安全的。当然，聚丙烯酰胺在食物中的含量远远高于化妆品中的含量，人体对于丙烯酰胺的摄入也多来自饮食。对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂，同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理（3）混凝凝聚和絮凝统称为混凝。4.加入助滤剂一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。常用的助滤剂有：硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土（特点：质轻、多孔、高强、耐磨、绝缘、绝热、吸附、稳定）。发酵液中的杂质a.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）b.杂蛋白在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。（一些高分子水溶液可以分为两个水相，蛋白质在两个水相中的溶解度有很大的差别，可以利用双水相萃取过程分离蛋白质等溶于水的生物产品。）在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。5.加入反应剂加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应，生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用淀粉酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。发酵液中加入某些盐类，可以除去高价无机离子。（一）、高价无机离子的去除方法1.Ca2+——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）；2.Mg2