栽培甘薯的基因组中包含土壤杆菌属T-DNA表达基因

栽培甘薯的基因组中包含土壤杆菌属T-DNA表达基因—自然转基因粮食作物的一个例子摘要：发根农杆菌和根癌土壤杆菌是植物病原菌,具有承载功能基因转移DNA片段(转移DNA(本文)]进入宿主植物基因组的能力。这种自然发生的机制已经应用于开发转基因作物,种植在超过世界10%的耕地上,尽管它们的使用可能会导致相当大的争议。当组装甘薯的小干扰RNA,或siRNAs用来作宏基因组分析时,从脓杆菌中发现了T-DNA同源序列。简单定量PCR,southern杂交,基因组步行,细菌人工染色体库筛选和测序，明确表明,在栽培甘薯(番薯甘薯(Ipomoeabatatas[L.]Lam.)基因组中发现了两个不同T-DNA区域(IbT-DNA1和IbT-DNA2)，这些外源基因在甘薯植物的不同组织中表达。IbT-DNA1被发现含有四个与iaaM,iaaH,c蛋白(C-prot)和(Acs)基因同源的土壤杆菌(orf)【开放读码框架】。IbT-DNA1存在于所有被检测的291种生物中，但在野生近缘中不存在。IbT-DNA2包含至少5个ORFs，与土壤杆菌的ORF14,ORF17n,根轨迹(Rol)B/RolC,ORF13和ORF18/ORF17n基因具有显著的同源性。IbT-DNA2在217个基因型中的45个基因型中被发现,包括栽培和野生种。我们发现,甘薯是自然转基因而形成的一种广泛和传统消费的粮食作物,可能对当前消费者对转基因粮食作物的安全性认识产生影响。关键词：水平基因转移|农杆菌属|食品安全甘薯|转基因作物水平基因转移(HGT)长期以来一直被认为是一种自然现象,尤其是在细菌之间,但在真核生物的基因组中也不断的被发现(1)。许多水平基因转移的实例包括基因从各种蛭形轮虫中的捐赠者中转移，(2)或者从细菌细胞内的沃尔巴克氏体转移到各种昆虫和线虫的基因中(3,4)。有些转移的基因在受体中不是功能性的，而其他的被转录，形成获取新基因的运行机制。一些水平转移基因经被认为与特定表型的发生有关。例子包括类胡萝卜素生物合成基因从真菌转移到蚜虫中,导致蚜虫的颜色呈红色或绿色(5),或基因从角苔类植物转移到蕨类植物中,导致形成更有效的感光体蕨类。HGT从微生物到植物的转移有广泛的记录。也许最熟悉的例子是T-DNA从农杆菌中的转移。这个水平转移基因经常导致冠缨的发生，他的转移机制被广泛研究并被普遍的理解(7、8)。冠瘿病是果园和葡萄园影响尤为严重的一种疾病。长久以来,它被认为是细菌引起的(9)。19世纪70年代,发现了冠缨病是由于一部分Ti质粒【肿瘤诱导质粒】的转移产生的，T-DNA从根癌土壤杆菌进入到寄主植物。T-DNA的从相关细菌即发根农杆菌的Ri【毛根诱导质粒】质粒转移，在侵染位点诱导产生丰富的增殖根。一旦集成，T-DNA基因就会被表达出来，诱导产生瘤或毛状根，还在被侵染的植物组织中产生冠缨碱。冠缨碱的合成类型被用来区分Ti和Ri质粒属于章鱼碱、胭脂氨酸还是脓杆碱质粒。发根脓杆菌的农杆碱菌株在他们的Ri质粒中包含两个物理性的T-DNA区（TR-DNA和TL-DNA）。他们都独立地整合到宿主基因。TR-DNA通常编码冠瘿碱合成所需要的蛋白质，还有生长素生物合成基因（iaaM）【色氨酸过氧化酶】，（iaaH）【吲哚乙酰胺水解酶】和研究较少的编码C蛋白的（ORF）。TL-DNA包含ORFs，编码根轨迹（ROL）基因的RolA（ORF10），ROLB（ORF11），RolC（ORF12）和RolD(ORF15）等，参与生长素/细胞分裂素的平衡。另外还有其他功能还不太清楚的基因如ORF8，ORF13，ORF14，ORF18（18，19）等。ROLB，RolC，ORF8的5'，IAAM的5'，还有其它高度分化的T-DNA基因，他们的DNA相似性还未检测，但在白质水平有显著的相似性（20）。意义测试的291种种植红薯,都包含一个或多个转移DNA序列(T-DNA)。这些序列,在栽培甘薯克隆(“Huachano”)中被表达，通过详细分析，认为土壤农杆菌属侵染发生在进化时期。T-DNA的某一种显然存在于所有的栽培甘薯克隆中，但是在与野生亲缘关系密切的作物中却不存在。认为T-DNA在进化过程中提供了一个特性或者被选择的特性。这个发现把研究的重点集中到了植物与微生物的互作作用，得出了这种吃了几千年的作物也是转基因植物的结论，也许能够改变人们对转基因作物“非自然”状态的看法。农杆菌介导基因转移被发现后不久，就有报道说烟草基因中存在发根农杆菌T-DNA。这些来源于不同发根农杆菌菌株的T-DNA序列表现在烟草属植物中，并传递给下一代，但他们表达水平较低，而且与土壤杆菌侵染而引发的发根和根瘤没有什么联系。蓝粉烟草中的Rol基因在烟草的不同发育过程和形态特征的表达上起着非常重要的角色，为该属的进化做了贡献。利用PCR和基础杂交在茄科植物中寻找转基因物种没有获得成功。然而，随着更广泛的研究，发根农杆菌的T-DNA同源序列在柳穿鱼中被识别到了。烟草和柳穿鱼都是可食用的作物，但这些发现到目前为止都没有与驯化的可食用作物相联系上。在甘薯植株的小干扰RNA或siRNAs的高通量序列分析中发现，siRNAs与农杆菌T-DNA-likes序列的同源性存在于栽培甘薯“Huachano”中。这个结果促使我们进一步深入研究T-DNA在这种作物和与他相关的野生物种中的存在。甘薯是美洲最古老的驯化作物之一，它的考古遗址从秘鲁的智利卡峡谷洞穴往前可以追溯到8000到10000年前。和他最近的野生亲缘属于番薯属（旋花科），而且只局限于Batatas(Choisy)D.F.Austin系列的EriospermunHallierf.部分。它包括13个种和两个自然发生的杂交。他们中，除了五爪沙参以外，均为美洲特有，栽培甘薯是六倍体，尽管野生四倍体被收集在厄瓜多尔、哥伦比亚，危地马拉和墨西哥。其他种的甘薯有的是二倍体，也有四倍体。甘薯的野生祖先的身份还未完全确定，尽管分子和细胞遗传学研究都认为与野生二倍体甘薯关系密切。然而，我们寻找的部分甘薯基因组的T-DNA包含一大部分的驯化和半驯化的甘薯(以下简称栽培种，其中包括地方品种，品种和野生的六倍体甘薯)以及与野生甘薯相关的物种。结果：甘薯基因组包含土壤杆菌属T-DNA。甘薯“Huachano”的小RNA序列执行过程中(29),一些重复被重新组装表现出与农杆菌属基因[grocinopine合成酶(Acs),c蛋白(C-prot)，iaaH,iaaMRolB和ORF18）]的明显的相似性。来自这些重复的PCR产物的序列证实了甘薯DNA中存在这些基因。随后，使用基因组步移技术来识别从土壤杆菌属插入到甘薯“Huachano”基因组中的两个大的T-DNA区(Fig.1)。进一步的研究表明了,第一个区,甘薯T-DNA1(IbTDNA1),至少有四个与农杆菌属的Acs,C-prot,iaaH和iaaM序列，以及一个反向的截断iaaM的连续完整的orf同源,(图1和数据集S1)。第二个区，IbT-DNA2,至少包含5个与发根农杆菌ORF14，ORF17n,RolB/RolC家族,ORF13和ORF18/ORF17n家族具有显著同源性的完整的orf(图1b和数据集S1)。IbT-DNA1的侧翼序列(图1A),通过基因组步移技术,显示至少80%的序列参与了烟草、桑属,茄属植物和草莓属的F-box基因的检测。该区F-box蛋白的tBlastX分析预测是通过许多其他科植物数据集(S2)。甘薯的基因组猎枪文库美国国家生物技术信息中心，他们预测了F-box蛋白的编码。这些结果表明，“huachano”的IbT-DNA1被插入到一个的内含子。用Southern印迹分析来确认两个T-DNA已插入到甘薯基因组中。每个T-DNA约有4个副本。当通过基因组步移比较这些副本与两个T-DNA序列，并不能确定每个T-DNA的三个同源序列是因为多态性SpeI位点和等位基因，或者因单独整合而出现的独立，或者重新组合后形成的独立体而导致的。总基因组DNA的杂交，用SpeI消化，用探针使IbT-DNA1(C-prot,探针1;图1A)产生几个条带(图2A)，同样的情况也出现在(Fig.2B)，当杂交探针对应侧翼植物DNA(F-box,probe2;Fig.1A)，就能确认他们基因位点间的连锁。另外的条带与探针2杂交(Fig.2B)，表明至少有两个附加的DNA区与F-box基因同源，与IbT-DNA1链接，基因组中表达，很有可能被认为是甘薯F-box转录的原因。利用IbT-DNA2探针再次杂交(ORF17n,probe3;Fig.1B)得出了这个位点在甘薯基因组中存在(Fig.2C)。利用核苷酸水平的系统发育分析来阐明ORFsfromtheIbT-DNAs和带有农杆菌菌株普遍特性的Ri/Tiplasmids之间的关系(Fig.3)。从iaaM(IbT-DNA1)和ORF13(IbT-DNA2得到的核苷酸的组织结构和树形图)证实了所有的这些序列都是同源的。IbT-DNA1扰乱了甘薯基因并被表达细菌人工染色体(BAC)克隆证实了T-DNA插入到红薯F-box基因中，这个克隆是通过之前筛选的甘薯品种“Xu781”的BAC文库来确定的，使用iaaM【色氨酸过氧化酶】和C-prot特定引物(图4A)。TheBAC序列(79,099bp)表明在“Xu781”中包含完整的IbT-DNA1,22,146bp,被固定在两个T-DNA边界序列之间，由一个“Huachano”中的IbT-DNA1反向重复组成(Fig.4B).它包括Acs,C-prot,iaaH,和iaaM基因,还有一个包含几个短的重复序列而且与Gypsy2型长末端重复转座子插入到iaaM的一个副本相似的区段(Fig.4B)，还有一个310bp的删除部分在C-prot的一个副本中(在对照中,the“Huachano”IbTDNA1有一个910-bp的删除部分在iaaMgene的一个副本中)。他位于序列的两侧，与已检测到的F-box蛋白假定的外显子匹配记录相对应，确定了IbT-DNA1这个基因的内区。BAC区检测到的额外的基因表明IbT-DNA1被定位在染色体的转录活性区域(Fig.4A)。这个猜测是因为与已公布的甘薯转录组中获得的序列近乎完美的同源性而得到支持的，但是除了甘薯的LINE型逆转录转座子。因此，IbT-DNA1的插入几乎打乱了T-DNA插入之前可能具有功能性的番薯属基因。两个连续的的F-box基因（有印迹分析诱导的）可能补尝了中断的同源基因的损失。T-DNAORFs的表达是使用甘薯地方品种“Huachano”，通过定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法测试的。这个分析表明他的存在性低，但可检测到，这些基因的mRNAs存在于叶、茎、根、苗端,和存储根组织中(图5)。这个观察证实了这些ORFs在甘薯中被表达。IbT-DNA1在甘薯中无处不在，但IbT-DNA2却不是，而关系很近的物种间没有或只有一个T-DNA。为了研究在栽培甘薯基因库中T-DNA序列的表达，进行了三四个IbT-DNA1的ORFs和IbT-DNA2的ORF13的PCR分析。总共分析了291个，还有204个IbTDNA1和IbT-DNA2来源不详的生物，这表示是甘薯基因库六倍体的随机抽样。这些材料搜集自中美、南美，非洲、亚洲和大洋洲。10个四倍体植物(9个甘薯和1个番薯)和3个二倍体植物(2个I.trifida【甘薯的近缘野生种】andone三裂叶薯),表型密切相关的类群也包括在这个分析中。结果在DatasetS3中，IbT-DNA1被检测到存在于所有被测的291种甘薯栽培种中，但是野生种中就没有。相比之下，在总共被检测的217个基因型中，IbT-DNA2的ORF13被检测到存在于42个六倍体栽培种中，9个甘薯四倍体品种中的2个和1个单独的二倍体野生近缘种中。测试的基因型来自不同的种质资源，分析也是在两个不同的实验室单独进行的。IbT-DNA2和根的特性。在烟草中，Rol-containing基因型具有生根特性