潘龙(移植胰岛损伤的研究现状)

·大会交流·移植胰岛损伤的研究现状潘龙罗思谯杜成友400016重庆，重庆医科大学附一院肝胆外科胰岛移植能模拟生理状态下的胰岛分泌，可较理想的长期控制血糖，预防糖尿病远期并发症。移植后胰岛细胞的功能及受体对免疫移植剂的耐受成为影响移植成败的关键。本文就移植胰岛损伤机制、移植胰岛功能丧失的早期检测、延长胰岛功能的方法综述如下。1移植胰岛损伤相关机制的基础研究1.1移植前损伤移植前的胰岛在胰腺采取，胰岛分离纯化及低温保存过程中即已经发生胰岛功能的丢失。尸体来源的胰岛仍然是目前移植胰岛的主源，在脑死亡后大量的炎性介质，如TNF-α，IL-1β，IL-6等表达上调。Contreras等【1】关于鼠类的研究发现，脑死亡后胰岛细胞的功能在体内及体外实验中皆表现出下降趋向。在动物【2】和人【3】的实验中都发现了氧化应激反应可能是触发胰岛及其周围组织死亡的因素。抗氧化剂可改善胰岛的生存及功能【4】。目前移植前损伤的研究尚未完全明确。1.2免疫损伤1.2.1T细胞活化的共刺激信号移植免疫中最核心的环节是T细胞活化。移植胰岛排斥过程中T细胞的激活存在共刺激信号。T淋巴细胞介导的免疫排斥反应除需T细胞受体与抗原递呈细胞上的MHCII类抗原作用外，还需第二信号，这种信号的转导是通过T细胞表面的CD28和APC表面的B7分子家族（包括B7-1，B7-2，CTLA-4,ICOS，ICOS配体等）以及TNF／TNFR家族（CD40/CD40配体，4-1BB配体/4-1BB,OX40配体/OX40,CD70/CD70配体等，其中最重要的是CD40/CD40配体）完成的。当只有第一信号的刺激，而缺乏共刺激信号，T细胞就不会活化，导致抗原特异性的免疫无反应状态，即T细胞处于无能状态。因此，阻断共刺激信号可抑制免疫排斥反应。1.2.2免疫损伤1.2.2.1T细胞免疫作用移植胰岛损伤的与T细胞免疫密切相关。CD4+辅助性T细胞（TH）产生大量细胞因子，促进其它细胞活化并发挥其功能，如CD8+CTL，NKT细胞，B细胞等。CD8+T细胞主要是特异性直接杀伤靶细胞，在各种排斥反应中亦占有重要地位，其细胞毒作用主要依靠Fas配体和穿孔素两种机制。动物实验发现，不同器官移植中各种T细胞对排斥反应的作用及机制是不同的，胰岛移植中起排斥反应的主要细胞及其作用方式在不同种不同器官移植中是不同的。Devos【5】等建立先天免疫缺陷裸小鼠模型进行异种心脏移植及异种胰岛移植，重建CD4+T细胞后两种移植物均发生了免疫排斥，并可检测到高滴度的异种抗体IgM、IgG。此外，还可观察到抗体和补体在移植心脏的沉积，而在移植胰岛无沉积。在输注CD8+T细胞后，异种移植心脏发生迟发型排斥反应，不伴有异种抗体的产生，而异种移植胰岛无排斥反应。在胰岛移植的排斥反应中，CD8+T细胞是否通过了Fas配体和穿孔素两种经典导致胰岛损伤亦具有争议。Sleater等【6】发现单独中断T细胞源性的穿孔素或者同种异体FasL表达对急性移植胰岛排斥的影响甚微，而同时中断二者则可阻止排斥反应，表明排斥反应中二者的作用是可互相替代但又是必须的。Diamond等【7】向联合免疫缺陷患者注射纯化的同种异体CD8+T细胞后建立同种异体胰岛移植，结果显示CD8+T可不依赖传统的细胞毒途径而产生移植物排斥，IFN-γ可能起重要作用。Lunsford等【8】的研究显示不依赖于CD4+T细胞的CD8+T细胞可导致胰岛的晚期丢失，这种机制的存在使传统免疫抑制剂治疗效果欠佳。因此，同时选择阻滞CD4+T细胞依赖途径和CD8+T细胞依赖途径的药物可能保护胰岛免受早期或晚期的免疫损害。此外，调节T细胞在胰岛移植中所起的重要作用，也被学者关注。Giraud等【9】对老鼠同种异体胰岛移植的研究表明，通过清除发育中的T细胞干扰T细胞的稳态，从而上调调节T细胞的比例，可能提供一种获得抑制胰岛免疫耐受的方法。1.2.2.2早期体液免疫各种细胞因子参与对移植排斥反应的调控。在胰岛移植的早期，植入部位的炎性介质引起的非特异性炎症在胰岛早期损伤中伴有重要角色。IL-1β是其中最重要的炎性介质之一。IL-1β由活化的巨噬细胞或中性粒细胞分泌，通过上调可溶性NO合酶及COX-2，诱导胰岛去功能化及胰岛细胞凋亡，在胰岛移植的动物模型中证实阻止其释放可改善胰岛损伤【10,11,12】。另外，组织因子可触发一有害的凝集反应，即刻经血液介导的炎症反应(Instantbloodmediatedinflammatoryreaction，IBMIR)，此反应是移植初始阶段胰岛损伤的主要因素，造成移植时必须有更多的胰岛输入。组织因子的浓度越高，激活此反应的能力越强【13】。抗血栓形成药物可降低此反应对移植胰岛的损害。Cabric等【14】将胰岛经肝素预处理后发现，无论在体外试验还是同种异体猪胰岛移植的模型中，此肝素被膜都能有效减轻IBMIR。其它细胞因子的研究也可能成为抗胰岛细胞凋亡，保存胰岛功能的方法，如缺氧诱导的血管内皮生长因子，IL-2。1.3移植部位与胰岛损伤目前选用的胰岛移植部位有肝内、脾内、大网膜、小网膜囊、腹腔内、皮下、肌肉内、睾丸内、胸腔内、肾包膜下及脑内等。肝内、脾内等处移植胰岛分泌的胰岛素经肝脏代谢而较符合生理。移植器官的细胞及体液环境能对移植胰岛的存活产生影响。Chen等【15】研究发现，小鼠肝脏内的星形细胞具有免疫调节活性，将其与胰岛协同移植可保护同种异体的移植胰岛。Pileggi等【16】发现胰岛经门脉系统输入后，最终停留在门静脉终末分支内，此处氧分压仅为8mmHg～10mmHg，而胰腺内的氧分压为40mmHg。肝脏是免疫活性较强的器官，非特异性炎症反应IBMIR发生率亦较高，这些因素常导致胰岛细胞大量丢失。而睾丸处为免疫豁免区，对减轻胰岛排斥反应可能有益。1.4移植胰岛的再血管化胰岛是血供丰富的组织，对鼠类的研究发现，占胰腺体积0.3%的胰岛接受了胰腺6%的血供【17】。在从胰腺分离供体胰岛的过程中，原有的胰岛血管遭到破坏。移植胰岛需再血管化，研究发现这个过程约14d，在这段时间内甚至是再血管化后，移植胰岛处于缺氧状态，移植胰岛血管密度低于正常水平【18】。提高移植胰岛的再血管率或加快再血管化进程的因素能减轻移植胰岛的丢失。血管内皮细胞对移植胰岛的再血管化具有重要作用。将血管内皮细胞（endothelialcell，EC）和骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）混合被覆于胰岛，经体外培养后，这种EC-MSC被覆胰岛的血管新生率较仅用内皮细胞被覆者增加2倍，并且前者具有与后者相同的功能及存活率【19】，但供体胰岛含有内皮细胞越多，诱发抗供体组织相容复合物同种免疫的风险亦越高【20】。免疫缺氧诱导的血管内皮生长因子具有促进再血管化的作用，将其与移植胰岛共同包被能减少胰岛丢失。胰岛损伤与众多机制相关，目前移植胰岛的损伤机制尚未完全明确，需待继续探讨。随着临床胰岛移植开展的深入，可获更多关于胰岛损伤机制的佐证。Smith等【21】对1例胰岛移植后2年的高血压卒中患者研究发现，其残存胰岛中无免疫损伤相关因素的证据，推测胰岛损伤的非免疫因素有解剖或药物因素等。2胰岛损伤的检测2.1功能检测移植后胰岛细胞功能恢复是标志移植成功的重要指标。目前广泛使用的指标包括血糖测定、C肽测定、糖基化血红蛋白测定等。血糖测定和C肽测定能直接反应胰岛素分泌状况，而糖基化血红蛋白则可反映一段时间（4～8周）前的平均血浆葡萄糖浓度。Shapiro等【22】研究发现7例接受胰岛移植并采用不含激素的免疫抑制方案的1型糖尿病患者（此即著名的Edmonton方案），接受移植后患者不需胰岛素治疗，也未再发生严重低血糖，检测其糖基化血红蛋白值亦恢复正常。2.2胰岛损伤的早期检测胰岛损伤常先于胰岛功能障碍出现，早期检测发现胰岛损伤及其损伤机制有助挽救胰岛功能。目前对早期检测胰岛损伤仍然处于探索阶段，缺乏可靠灵敏的指标。研究较多的有胰岛素mRNA的RT-PCR检测法和血清可溶性CD30测定两种。2.2.1胰岛素mRNA的RT-PCR检测法（RT-PCRofinsulinmRNA）本检测基于损伤胰岛解体，胰岛细胞进入血液循环的假说，具有高度的灵敏性和特异性，能检测到1ml静脉血中的2个胰岛β细胞；在门静脉系统胰岛移植后10周即可检测到循环胰岛β细胞；而且血液循环中可检测到胰岛细胞的时间可能取决于移植物微环境及免疫抑制方案【23】。2.2.2血清可溶性CD30CD4+T细胞是sCD30的主要来源，前者在胰岛排斥的过程中扮演有重要角色。Saini等【24】在对接受同种异体胰岛抑制的小鼠和人的一项研究中发现，80%的排斥事件中，sCD30的升高先于排斥发生，sCD30增高常先于抑制胰岛失去功能前3～4个月发生。在人中，增高的sCD30常与不理想的预后相联系。因此其可能成为一个有价值的早期观察排斥反应的指标。3抗胰岛损伤的策略3.1抗排斥药物与其它器官移植不同，胰岛移植抗排斥药物具有其特殊性。由于许多传统免疫移植药物具有损伤胰岛，升高血糖作用，如环孢素、激素等，故胰岛移植抗排斥方案需避免选择这些药物。常选用的药物有阻断共同传导通路的药物，如抗CD40L（抗CD154）【25】，ICOSmAb【26】，CTLA4-Ig；诱导淋巴细胞凋亡的药物，如FIY72【27】；阻断胰岛细胞凋亡的药物，如环胞霉素与IL-2/FC【28】。3.2微囊化胰岛移植微囊化胰岛移植采用机械隔离及生物免疫隔离技术将移植胰岛包埋于半透膜中，宿主免疫系统与移植胰岛免疫隔离，同时对低分子营养物质、电解质、02和代谢产物具有通透性。该技术从理论上不需要应用免疫抑制剂，异种胰岛成为可选供体，解决了胰岛移植来源不足和移植排斥反应两大难题。但半透膜仍不能产生完全免疫隔离，补体、炎症因子等小免疫分子仍能进入微囊而诱发免疫排斥反应【29】，胰岛细胞上的小抗原分子也可以游离到微囊外诱发免疫反应【30】。大鼠实验中，将胰岛细胞与睾丸支持细胞等可提高胰岛细胞生存能力的细胞共微囊化可提高胰岛素产量【31】。3.3其他目前，常在大量输注胰岛的同时，使用肝素以保证发生IBMIR后具有足够的胰岛。移植部位的免疫、生理环境等因素也可能延长胰岛存活时间。通过改良移植胰岛的免疫活性也证实有效降低了排斥机率。促进胰岛细胞新生的物质，如肝细胞生长因子(HGF)，胎盘催乳素(PL)；促进胰岛血管生成的物质，如缺氧诱导的血管内皮生长因子等物质在动物试验中证实有促进胰岛血管生成的作用，如联合使用这些物质能否提高移植胰岛的生存有待进一步研究。总之，Edmonton方案的成功，使通过胰岛移植彻底解决糖尿病成为可能。由于移植失败后，重新使用胰岛素替代即可，对患者的影响较其它器官移植很小，故成为近年研究热点。移植胰岛排斥损伤的机制研究出现了许多亮点，带来了许多抗移植胰岛排斥新策略，并取得了具有临床意义的成果。胰岛损伤的早期检测也进入研究者的视野，并发现了一些有潜在价值的损伤标志物。胰岛移植排斥是众多免疫细胞、免疫因子及移植胰岛周围生理环境因素共同作用的结果，机制错综复杂，有待进一步阐明。胰岛损伤的早期检测仍然缺乏具有临床价值的公认有高特异性、高灵敏度的标志物，也无关于某一标志物的大数据统计研究。损伤标志物仍然有待发现，各标志物联合检测的有效性也需进一步探讨。参考文献[1]ContrerasJL,EcksteinC,SmythCA,etal.Braindeathsignificantlyreducesisolatedpancreaticisletyieldsandfunctionalityinvitroandinvivoaftertransplantationinrats[J].Diabetes,2003,52(12):2935-2942.[2]PileggiA,MolanoRD,BerneyT,etal.Hemeoxygenase-1inductioninisletcellsresultsinprotectionfromapoptosisandimp