梅毒的实验室诊断.

梅毒的实验室诊断检验科梅毒是一种几乎可以侵犯全身所有器官，而产生多种症状和体征的慢性传染性疾病。十六世纪初由欧洲传入亚洲，后蔓延我国。梅毒又称为杨梅疮、广东疮、疳疮、下疳、霉疮等。病原体为梅毒螺旋体，属于密螺旋体属，苍白密螺旋体苍白亚种(Treponemapallidumsubspeciespallidum)苍白亚种梅毒苍白螺旋体地方亚种地方性梅毒极细亚种雅司病密螺旋体属品他螺旋体品他病梅毒螺旋体的生物学特性1、直径0.10~0.15μm，有8~14个致密而规则的小螺旋，两端尖直。2、原生质圆柱体上紧绕着3~4根周浆鞭毛，故运动活跃，运动方式多样。3、G-，但不易着色。Fontana镀银染色呈棕褐色。4、在无活细胞的人工培养基中难培养，生长慢。5、抵抗力极弱，对温度和干燥特别敏感；对青霉素、四环素、红霉素等抗生素敏感。梅毒螺旋体梅毒的传播途径1、直接性接触2、血液传播：输血3、垂直传播：胎盘传播。4、间接传播：日常用品、接吻、哺乳、医疗器械等途径。梅毒的分期梅毒的实验室检测方法显微镜检测法：（1）暗视野显微镜检查（2）镀银染色检查血清学检测法：非梅毒螺旋体抗原血清试验（1）VDRL(性病研究实验室试验)：需灭活（2）USR（不加热血清反应素试验）（3）RPR(加速血浆反应素环状卡片试验)（4）TRUST(甲苯胺红不加热血清试验)梅毒螺旋体抗原血清试验（1）FTA-ABS（荧光法密螺旋体抗体吸附试验）（2）TPPA/TPHA（梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验、梅毒螺旋体血凝试验）（3）TP-ELISA（4）发光法（5）胶体金法暗视野显微镜检查标本类型：梅毒硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损的渗出液、淋巴结穿刺液方法：暗视野显微镜下查找梅毒螺旋体。结果：典型的梅毒螺旋体呈白色发光,其螺旋较密而均匀。运动方式：①伸缩其螺旋间距离而移动（主要方式）②蛇行式③旋转式评价：①.简单、可靠。②.早期：硬下疳（梅毒血清学试验仍阴性）。③.阴性不能排出患梅毒的可能性暗视野显微镜下的梅毒螺旋体螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最好方法，WHO指定其为性病实验室必备项目之一镀银染色检查基本原理：梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染色，从而可以在镜下观察到梅毒螺旋体结果：棕褐色的梅毒螺旋体血清学检测法梅毒螺旋体侵入人体后产生：抗心磷脂抗体：即非特异性抗体、反应素。两种抗体抗梅毒螺旋体抗体：非梅毒螺旋体血清试验抗类脂抗原的抗体即是反应素是机体对损害细胞和梅毒螺旋体表面所释放的脂类物质的免疫反应在感染后3~4周产生是IgM和IgG的混合体未经治疗可长期存在经正规治疗后这种抗体减少转成阴性是用心磷脂卵磷脂和胆固醇作检测抗原非梅毒螺旋体血清试验所有的非梅毒螺旋体血清试验的抗原基本成分都是一样的包括有VDRL试验USR试验RPR试验TRUST(甲苯胺红)试验基本成分是心磷脂卵磷脂和胆固醇抗原抗体结合形成复合物凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见上述方法的敏感性和特异性都基本相似非梅毒螺旋体血清试验是用梅毒螺旋体成分、抗原决定簇或重组抗原及合成肽来检测螺旋体抗体。非梅毒螺旋体抗原血清试验TRUST（甲苯胺红不加热血清试验）基本原理：在心磷脂、卵磷脂和胆固醇等组成的抗原中加入甲苯胺红，与待检血清中的反应素结合，形成肉眼可见的红色絮状物。定性试验(1)加样：吸取50微升血清（浆）放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈中。(2)加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原。(3)反应：将卡片置水平旋转仪旋转8分钟[(100±5)转/分钟]，立即在亮光下观察结果定量试验（1）稀释液准备：在圈内加入50微升生理盐水（根据需要确定稀释度），勿将盐水涂开。（2）加样：吸取50微升血清与各圈中生理盐水做系列稀释，并涂布整个圈内。（3）同定性试验中的(2)、(3)。凝集反应强度分级：3+～4+：圆圈内出现中到大的红色絮状物，液体清亮。2+：圆圈内出现小到大的红色絮状物，液体较清亮。1+：圆圈内出现小的红色絮状物，液体浑浊。—：圆圈内仅见红色集中于中央一点或均匀分散。孔号12345678稀释倍数原倍1:21:41:81:161:32阳性K阴性K生理盐水(ul)-50.050.050.050.050.0--样品(ul)50.050.050.050.050.050.0弃50.0--阳性血清(ul)------50.0-阴性血清(ul)-------50.0抗原悬液(ul)16.716.716.716.716.716.716.716.7操作步骤VDRLUSRRPRTRUST抗原成分心磷脂、卵磷脂、胆固醇同前+EDTA+氯化胆碱同前+EDTA+氯化胆碱+活性炭同前+EDTA+氯化胆碱+甲苯胺红抗原稳定性不稳定,1天稳定4℃～8℃保存12个月稳定4℃～8℃保存12个月稳定4℃～8℃保存12个月血清试验前处理需灭活不需灭活不需灭活不需灭活反应板及结果判断玻片，肉眼或显微镜玻片，肉眼或显微镜纸卡片，肉眼纸卡片，肉眼注释唯一用于检查脑脊液的试验，诊断神经梅毒结果容易判断结果容易判断一期敏感性（未经治疗）74%-87%77%-88%77%-99%77%-99%二期敏感性（未经治疗）100%100%100%100%晚期敏感性（未经治疗）98%99%98%99%四种非特异性试验方法比较TPPA荧光法密螺旋体抗体吸附试验基本原理：用超声裂解梅毒螺旋体制备抗原，致敏明胶颗粒，其致敏粒子与待检血清中的抗梅毒螺旋体特异性抗体结合，产生肉眼可见的凝集。操作步骤1.试剂准备：试验前将试剂和待检标本恢复到室温。2.加稀释液：每份样本做4孔，加标本稀释液加至微量反应板孔内，第1孔100微升，第2～4孔各25微升。3.样本稀释：取血清25微升加至第1孔，混匀后取25微升至第2孔，混匀后取25微升至第3孔，混匀后取25微升至第4孔，混匀后弃去25微升。4.加对照液：第3孔加未致敏颗粒25微升，第4孔加致敏颗粒25微升。5.混合：将反应板置振荡器振荡30秒。6.反应：置有盖湿盒，孵育2h，或放4℃冰箱过夜观察结果。结果判断1.观察加未致敏颗粒的第3孔，不出现凝集为有效试验。2.观察凝集反应强度：分级如下。4+：颗粒光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠。3+：颗粒光滑覆盖大部分孔底。2+：颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一颗粒环。1+：颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一明显颗粒环。±：颗粒沉集孔底，中央形成一小点。一：颗粒紧密沉积孔底中央。梅毒血清试验假阳性因素：技术性：标本的污染溶血操作失误生物学假阳性：某些疾病：结核、疟疾、肝病、红斑狼疮、流感、肺炎、类风湿性关节炎、风湿性心脏病、风疹、系统性硬化症等，疾病发展过程中释放心磷脂到血液中假阳性。生理机能发生变化：少数孕妇也可发生生物学假阳性。TRUSTTPPA临床意义——初期梅毒早期或排出++现症梅毒+—生物学假阳性—+梅毒经治疗后早早期梅毒梅毒实验室检测的特点临床表现取材部位检查方法一期梅毒溃疡淋巴结病原学检查血液血清学检查二期梅毒皮损淋巴结病原学检查血液血清学检查潜伏梅毒血液血清学检查三期梅毒血液血清学检查神经梅毒血液血清学检查脑脊液细胞、蛋白量检查VDRL等梅毒血清学试验的比较非梅毒螺旋体血清试验操作简单价格便宜有试剂盒便于携带适宜于人群的筛查试验可以用作治疗后的疗效观测和判愈的指标梅毒螺旋体血清试验敏感性和特异性均高FTA-ABS操作繁复需熟练的技术人员和实验室的设备TPHA有试剂盒用作确诊试验价格比较贵不能用于大量人群患梅毒后终身阳性不能用作疗后随访非梅毒螺旋体血清的假阳性反应定义:不存在梅毒感染但血清学反应呈阳性假阳性反应可分为技术性假阳性标本的采取保存运送和实验室操作的误差而产生可重复试验即可证实为阴性生物学假阳性事实上不存在梅毒感染而是其他非技术性因素所产生的阳性反应在““正常”的人群中发生率约为1/4000非梅毒螺旋体血清的假阳性反应急性生物学假阳性反应出现于非梅毒感染的感染性疾病特点:RPR呈阳性但滴度很低很少大于1:8在病情缓解后数周即转成阴性病程很少大于半年证实试验TPHA或FTA-ABS为阴性缺乏明确的梅毒临床证据非梅毒螺旋体血清的假阳性反应急性生物学假阳性反应的疾病风疹水痘传染性单核细胞增多症传染性肝炎上呼吸道感染肺炎球菌性肺炎病毒性肺炎牛痘疹非梅毒螺旋体血清的假阳性反应慢性生物学假阳性反应的疾病系统性红斑狼疮自家免疫性溶血性贫血盘状红斑狼疮结节性多动脉炎类风湿性关节炎桥本氏甲状腺炎风湿性心脏病干燥综合征毒品瘾者慢性肾炎肝硬化老年麻风(是唯一产生慢性生物学假阳性的感染性疾病)非梅毒螺旋体血清的假阳性反应毒品瘾者的假阳性反应:假阳性发生率高可达33.3%~94.8%毒品瘾者常与性乱有关常可同时感染梅毒医务人员在处理这些情况时要特别仔细非梅毒螺旋体血清的假阳性反应妊娠的假阳性反应这是一种生理情况下的生物学假阳性假阳性发生率较低有报告为0.4%滴度低非梅毒螺旋体血清的假阳性反应FTA-ABS试验的生物学假阳性系统性红斑狼疮类风湿性关节炎肝硬化淋巴肉瘤脑膜瘤海洛因成瘾自家免疫性溶血性贫血结肠癌麻风非梅毒螺旋体血清的假阳性反应FTA-ABS试验的生物学假阳性非常罕见系统性红斑狼疮占绝大多数真阳性呈均匀的荧光假阳性呈串珠状荧光鉴别需结合病史和临床综合分析血清学试验的特殊情况前带现象（Prozonephenomenon）在二期梅毒中临床症状很明显但RPR试验为弱阳性或阴性此时应该将血清稀释后再作会出现阳性结果这种情况称为前带现象发生率为1％～2％发生的原因主要是血清中抗体量过多与抗原量的比例不合适抑制了阳性反应的发生血清学试验的特殊情况血清固定（sero-risistance）表现；梅毒患者经过正规治疗和充分的随访（2年以上）一期梅毒随访1年二期梅毒随访2年晚期梅毒随访3年RPR试验仍不阴转这种情况是血清固定早期梅毒血清固定者有35％出现梅毒的复发血清学试验的特殊情况血清固定（sero-risistance）原因；早期梅毒是与机体的免疫抑制有关可能与体内仍有潜在的活动性病变有关与治疗剂量不足治疗较晚治疗不正规与复发再感染有关和可能发生神经系统梅毒有关晚期梅毒是与梅毒的类型和治疗较晚有关血清学试验的特殊情况血清固定（sero-resistance）处理；早期梅毒出现血清固定可作一次正规治疗晚期梅毒出现血清固定应作全面的检查以除外心血管神经或内脏梅毒作一次正规的治疗后定期随访不必过度治疗如RPR滴度没有反复可终止治疗血清学试验的特殊情况血清固定有报道血清固定者作IgM检测和外周血淋巴细胞亚群测定IgM阳性CD3CD4CD8T淋巴细胞高于正常人群NK淋巴细胞低于正常人群IgM阴性CD3CD4T淋巴细胞低于正常人群CD8和NK淋巴细胞高于正常人群说明血清固定者存在细胞免疫不平衡和免疫抑制NK细胞的降低可能与RPR阳性并具传染性有关梅毒治疗后的血清学观察早期梅毒治疗后要定期作血清学检查治疗后的6个月内RPR滴度应下降2个梯度否则应视为治疗失败第一年每3个月1次第二年每半年1次第三年末一次