森林冬虫草水溶性虫草多糖研究

森林冬虫草：水溶性虫草多糖研究虫草多糖由于其抗肿瘤作用、抗辐射作用和免疫调节作用，对人和动物无毒无害，对治疗肿瘤和感染所引起的免疫抑制有巨大的价值贡献。但迄今为止，所发现的虫草多糖多为胞内多糖，即是胞外多糖也是水不溶性的，增大了人体吸收的难度。因此，寻找生产免疫活性的水溶性胞外多糖的虫草新种，探讨生产虫草多糖和菌丝体的最佳条件就显得非常迫切和需要。本文对川藏森林冬虫草所含虫草多糖（CDP）的免疫调节作用，组成及液体培养条件进行了研究。研究结果表明：森林冬虫草所含虫草多糖CDP为水溶性胞外多糖，不像其它人工培植虫草虫草胞外多糖不溶于水而致人体难以吸收。草原冬虫草含有两种虫草胞内多糖CT-4N和CS-1，其产率为别为0.08%和0.77%。而森林冬虫草的水溶性虫草多糖CDP粗糖产量为16.75g/l，纯多糖产量也较高可达13.5g/l，明显高于上述几种多糖。实验中还论证了森林冬虫草所含虫草多糖CDP的具有免疫作用。首次发现森林冬虫草含有在虫草中稀见的脂溶性抗生素。因此脂溶性抗生素和CDP可望得到综合利用。森林冬虫草的服用安全性也得到论证。下面为实验过程和方法：【1】材料和方法1.1菌种提取自川藏森林野生冬虫草。1.2培养基1.2.1沙氏培养液（Sabouraud‘sBroth）:葡萄糖40g，蛋白胨10g，水1000ml。1.2.2马铃薯葡萄糖培养液（PDA）:取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1L，煮30分钟，纱布过滤，滤液中加葡萄糖20g，最终体积至1000ml。1.2.3察氏培养液（CZ）:蔗糖30g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4.7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水1000ml。1.2.4AM培养液：可溶性淀粉20g，葡萄糖20g，棉子粉4g，蛋白胨4g，土豆粉4g，MgSO4.7H2O0.4g，CaCO34g，蒸馏水1000ml，pH6.0。1.2.5黄豆粉葡萄糖培养液（SGM）：葡萄糖30g，黄豆粉5g，酵母膏2g，K2HPO41g，MgSO4.7H2O0.5g，蒸馏水1000ml。1.2.6完全培养液（CM）:葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母膏5g，蒸馏水1000ml。1.3方法1.3.1淋巴细胞转化实验：参阅林学颜（1980）方法。1.3.2菌丝产量测定：按俞大绂等（1985）方法。1.3.3多糖的提取：参阅李兆兰（1987）方法。1.3.4粗多糖重量的测定：取烘干恒重的粗多糖粉末放在电光分析天平上称重。1.3.5粗多糖纯度的测定：采用蒽酮—硫酸法。具体操作参阅张惟杰（1987）的方法。1.3.6纸层析：用新华1滤纸（24×10cm），乙酸乙酯-吡啶-水（10:4:3）为展开剂（吴梧桐等，1984）。显色剂为苯胺-磷酸试剂，4g二苯胺，4ml苯胺及20ml85%磷酸溶于20ml丙酮（张惟杰1987）标注品与样品含量均为10mg/ml左右。1.3.7培养方法静置培养：25℃恒温培养24天。200ml三角瓶100ml培养液，接种量5ml。100ml三角瓶装20ml培养液，接种量0.5ml。振荡培养：24~26℃，振床转速100~110r/min200ml三角瓶装去100ml，接种量5ml，4个重复。与多糖有关的实验中，7~8个重复，多糖是7~8瓶所含的多糖之和，折合成每升培养液所产生多糖的量。生物量取4个最接近的数值平均值。数据处理：仪器为CASIOfx-3600p函数计算器。采用LSR法。【2】实验结果2.1森林冬虫草水溶性胞外多糖（CDP）对淋巴细胞转化的影响本试验所用森林冬虫草水溶性胞外多糖（CDP）粗品用SGM培养液生产，纯度为80%。CDP转化率比对照增加16.2倍，说明CDP有促进淋巴细胞转化作用，但与PHA合用无协同作用。该种情况在用银耳子实体多糖（TF）所做的淋巴细胞转化实验中也出现，说明不是偶然现象。2.2森林冬虫草水溶性胞外多糖（CDP）的分离纯化及组成单糖的鉴定。取森林冬虫草水溶性胞外多糖（CDP）粗品干粉3g,溶于30ml热水中，离心除去不溶物，用Sevag方法除蛋白，干燥备用。取0.1g脱蛋白多糖，经SephadexG-200柱（2×60cm）分离，洗脱液为0.1MNaCl,流速为0.25ml/min，分管收集，每管3ml，蒽酮法检测。洗脱曲线见图1,由此图可知仅有一个峰，说明CDP只有一个组分，利用分子排阻法推测其分子量200,000左右。合并含糖量高的洗脱液25ml透析至无Cl-为止，然后用PEG6000浓缩至1ml，加入5ml2N硫酸，封安瓿80℃水解24小时，取出用BaCO3中和，过滤除去BaSO4沉淀，即得多糖的水解产物。点样进行纸层析，结果见图2。从左至右以此为山梨糖、鼠李糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、CDP水解液，其Rf值分别为0.29、0.54、0.41、0.2、0.23、0.23，说明CDP水解产物为葡萄糖组成，CDP为一种葡萄聚糖分子。2.3温度对森林冬虫草菌种生长的影响不同温度对虫草菌丝产量的影响很大。森林虫草菌株生长的最是温度范围为25~29℃。当温度上升到37℃时，未测出菌丝干重，经镜检分生孢子没萌发，此温度为菌丝生长的极限温度。2.4培养基对虫草的菌丝产量和胞外多糖产量的影响不同培养基处理对菌丝产量和胞外多糖产量影响很大。由图5可知，菌丝产量最高的培养基为SGM，达到1.24/100ml。其次为CM，是最高产量的80%，AM和Sab相差不大，产量最低的为PDA和CZ培养基。由图6可知，多糖产量最高的培养基也是SGM，纯多糖产量可达13.54g/l（粗多糖产量为6.75g/l）。其次为CM，只是最高产量的14%，其后以此为AM、Sab、PDA、CZ。CZ几乎不产多糖，只有0.03g/l是最高产量的0.2%。由此可见，最有利菌丝和多糖生产的培养基为SGM。【3】分析和讨论淋巴细胞转换试验表明CDP有促进淋巴细胞转换作用，说明CDP具有免疫调节作用。而且CDP为水溶性胞外多糖，不像其它虫草胞外多糖不溶于水而增加了人体吸收的难度。草原冬虫草含有两种虫草胞内多糖CT-4N(Kino,etal，1986)和CS-1(Miyazaki,etal,1977)，其产率为别为0.08%和0.77%，即是研究较多的裂褶菌多糖，胞外粗多糖产量只有5.37g/l，纯多糖产量只有2.15g/l(李兆兰，1987)。而森林冬虫草的水溶性虫草多糖CDP粗糖产量为16.75g/l，纯多糖产量也较高可达13.5g/l，明显高于上述几种多糖。菌丝产量也较高达到1.24g/100ml。此外，森林冬虫草含有首次在虫草无性型中所发现的脂溶性抗生素。因此脂溶性抗生素和CDP可望得到综合利用。森林冬虫草菌种在37℃时分生孢子不能萌发，菌丝不能生长。人的正常体温为36.5~37.5℃，各种家畜、家禽的温度更高，森林冬虫草菌种不可能在此温度下生长。因此，森林冬虫草服用对人、家畜、家禽是安全的。参考文献1、焦彦朝等。虫草生物活性物质研究概况。贵州农业科学，1990，（3）:53~582、李兆兰。裂褶菌深层培养及多糖测定。真菌学报，1987,6（3）170~1773、梁宗琦，刘爱英等。虫草一新种及其绿僵菌无性型。真菌学报，1991,10（3）：172~1804、林学颜编，免疫学基础。福州，福建科技出版社，1980:184~1875、吴梧桐等。银耳孢子多糖TF-A、TF-B、TF-C的分离、纯化及组成单糖的鉴定。生物物理与生物化学学报，1984,16（4）：393~3986、俞大绂，李季伦编。微生物学（第二版）。北京：科学出版社，1985：682~6907、张惟杰主编。复合多糖生化研究技术。上海：上海科技出版社，1987:1~218、KinoTetal.Aminorprotein-containinggalactomannanfromasodiumcarbonateextractofCordycepssinensis,CarbonhydrRes,1986,155:189~1979、MiyazakiJetal.studiesonfungalpolysaccharides.XXGalactomannofCordycepssinensisChempharmBull,1977,25(12):3324~332810、ToshihiroOetal.StructureofagalactosaminoglycanfromC,ophioglossoides.CarbonbydrRes,1984,134(2):275~282·11、YamadaHetal.Structureandantitumoractivityofanajki-solublepolysaccharidefromC.ophioglossoides.CarbonbydrRes,1984,125(1)：107~116