植物分子标记技术研究进展1

农业生物技术课程论文题目：_植物分子标记技术研究进展院（系）：农学院专业：农学班级：农学081班姓名：任喜龙学号：01108010成绩：完成日期：植物分子标记技术研究进展摘要：对几种常见分子标记RAPD、AFLP、SSR、ISSR、进行原理与特点简述，并介绍这几种分子标记在植物品种鉴定、分子标记辅助育种、植物空间诱变育种中的重要运用，再结合现在的研究情况简述它们的应用前景。关键词：分子标记RAPD、AFLP、SSR、ISSR、植物品种鉴定、分子标记辅助育种、植物空间诱变育种近年来，分子标记技术在生物学领域运用备受亲睐。有关分子标记技术的概念有两点，广义上讲，分子标记技术指指可遗传的且可检测的DNA序列或者蛋白质；狭义上讲，分子标记技术指能反映生物个体或群体间基因组中某种差异的特异性DNA片段。常见的分子标记技术有RAPD、AFLP、SSR、SRAP、ISSR。该技术备受亲睐的原因是分子标记作为继形态标记、细胞标记、生化标记之后发展起来的一种更为理想的遗传标记形式，能够直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，且不受季节、环境限制，也不存在表达与否的问题；分子标记数量极多，遍布整个基因组，可检测的基因座位没有极限；其多态性高，自然界存在许多等位变异，无需人为创造；又不影响目标性状的表达，与目标性状无必然的连锁遗传现象，表现为“中性”；许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。一、分子标记1、RAPDRAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。基本原理：利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。特点：(1)技术简单，检测速度快；(2)RAPD分析只需少量DNA样品；(3)不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；(4)成本较低。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；(2)存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；(3)RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。2、AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。AFLP是RFLP与PCR相结合的产物。基本原理：先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1—3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3’端的选择碱基序列（1—10bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。特点：所用的专用引物可在知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而AFLP分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP结合了RFLP和RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管AFLP技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。3、SSR也称卫星DNA，其串联重复的核心序列为1一6bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA)n和(TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。特点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。4、ISSR由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年发展起来的一种基于微卫星序列的分子标记技术,这一技术是依据真核生物基因组具有丰富的高度串联重复序列而提出的。基本原理：利用基因组中存在的简单重复序(simplesequencerepeats,SSR)本身设计引物,在SSR的3∃或5∃端加锚1-4个随机碱基,然后以此为3∃或5∃引物,对两侧具有反向排列的SSR之间的基因组片段进行扩增。特点：ISSR结合了RAPD和SSR的优点,具有较好的稳定性和多态性,但ISSR标记产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD更加丰富,可以提供更多关于基因组的信息。因此,ISSR标记被认为是居群遗传多样性研究的一种有效的分子标记手段。Hu等利用ISSR分子标记方法研究了唐古特大黄野生居群的遗传结构和遗传变异,结果显示,在物种水平上,唐古特大黄多态位点百分率为92.94%,Nei基因多样性指数为0.2689;居群水平上多态位点百分率为46.51%,Nei基因多样性指数为0.1724,无论是居群水平还是物种水平,唐古特大黄均具有较高的遗传多样性。遗传距离与地理距离的Mantel检验表明,二者呈显著的正相关。同时,还探讨了唐古特大黄的遗传多样性与生态因子的关系,其遗传多样性与海拔呈显著的正相关,与纬度和年平均气温呈显著的负相关,因此,海拔和温度可能是影响唐古特大黄遗传多样性的重要外部因子。二、分子标记技术应用1、植物品种鉴定品种鉴定要求具备高效、准确、不受环境等因素影响的鉴定技术。传统田间性状鉴定和籽粒形态鉴定简单易行，但受栽培措施及环境因子影响较大，容易影响检测准确性。而利用同功酶和蛋白质电泳图谱的鉴定技术虽灵敏度高、准确、易操作，但同功酶位点及蛋白质种类是有限的，不能完全显示品种间的多态性，也很难满足种子纯度和种质资源及育种工作发展的需要。而分子标记技术提供了更为有效的品种鉴定方法，利用分子标记可以绘制品种(系)的指纹图谱，作为品种(系)的特征性状建立种质资源档案库，可用于鉴别品种(系)。目前，分子标记技术在植物品种鉴定中应用较为普遍。Raul等对23个油橄榄品种进行了SSR分析，用来检测其l1个后代的父本或潜在父本，结果表明其中4个为自交子代表现为纯合，这说明在油橄榄育种中SSR是一种有效评价杂种和自交不亲合的技术。Angiolillo等利用AFLP技术对43个油橄榄品种和野生种进行了遗传相似程度的计算，并建立了遗传进化树图。吴树敬等从100个随机引物中筛选得到18个引物，对参试杏品种进行扩增，均具有多态性，多态性达48.6％，找到了重现性好的品种特异谱带。建立了20个品种的指纹图谱，每个引物的鉴别率在10％～70％之间，用不同的引物组合结合特异谱带可以鉴别所有的参试杏品种，证明RAPD技术是果树品种鉴定的有效方法。温强等采用ISSR分子标记技术，仅用9条引物就建立了25个无性系的鉴别体系，其中受检测的108个位点中，特征位点就达95个，引物UBC895贡献20个位点，可一次性鉴别25个无性系，无论从扩增多态性还是鉴定效率上都具有显著效果，各无性系具有各自不同的指纹，也同时论证了各无性系遗传背景相对独立，这为优良无性系进一步向良种推广应用以及在无性系基础上进行种质杂交创新奠定了一定的分子基础。Fabbri对分布于地中海地区的17个油橄榄品种，用40个随机引物进行扩增，结果发现，这些油橄榄的种质资源中存在大量多态性。经过聚类分析，这17个品种可分为小果群和大果群二大类型，与形态学分类一致。2、分子标记辅助育种分子标记辅助选择即用DNA水平上的选种来代替以表型为基础的选种，通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记来判断目的基因是否存在。通过分子标记分析高效、准确、迅速地可筛选出与目的基因(性状)紧密连锁的DNA片段或QTL，作为辅助育种的分子标记。由于分子标记不受环境、生长发育的限制，故可进行早期选种，从而能够大大缩短世代间隔，提高选种强度、选种效率和准确度。另外，对某些非目标性状的性状也能够及时发现和淘汰，据实践表明，应用分子标记进行间接选种将会得到事半功倍的效果，特别是抗性育种。Mekuria油橄榄抗叶斑病材料上获得了与抗病基因连锁的RAPD标记，并成功地将其转化为TS标记，在12个油橄榄栽培品种中得到了验证。黄永芳等用RAPD标记技术分析90份油茶种质，获得与油茶抗病性、果油率和产油量3个数量性状显著相关的谱带分别为13.1％、25.2％和4.5％，为选育高产、抗病的优质油茶品种，缩短育种进程，提高育种效率提供了参考。史学群等试验结果表明，尽管在不同生境下所观察到的枫香树种外部差异明显，但在遗传物质上却没有大的差异，因此认为光照对枫香的生长密切相关，其种群不适合生长在林下。Rosa等应用RAPD、AFLP和SSR技术，在Leccino的基因组中标记了决定油橄榄果实中饱和与不饱和脂肪酸比率的硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶基因(SAD)，此基因标记在Leccino的第4连锁群中。杨克强等用BSA法获得了与核桃早实性状相关的RAPD标记OPB—08，并对早实和晚实桃品种进行了DNA扩增，只在早实品种的扩增产物中出现此条带，并测出该标记序列为核桃基因组所独有。NadiaGoue等用RACE技术(cDAN末端快速扩增技术)来隔离核桃CDKA基因的完整序列，并对该基因的结构与功能进行了首次描述，据其报道该基因与核桃木径向生长和出材量有关。王金彦等对花生EST-SSR分子标记结果表明，在NCBI数据库中，共获得437个SSR，占非冗余序列的6.0%。在Unigene基因文库中，共获得641个SSR，占非冗余序列的16.1%。尽管我们从NCBI中获得的无冗余序列要比Unigene文库中要多，但所获得的含有SSR位点的序列却不及Unigene文库。这可能是由于在NCBI数据库中，大多数序列都是由较短的并且重复性较大的序列组成，而在Unigene文库中，由于重复性较少，而且序列也较长，因此含有SSR位点的数目也较多。3、植物空间诱变育种植物空间诱变育种即航天育种或太空育种,指在植物育种过程中利用航天技术,通过返回式卫星或其他可回收型空间飞行器,将待育种子带到200~400km的太空中,经过太空特殊的环境对种子进行处理,使植物种子产生有益的变异,返回后再经过地面选育,以获得优良新品种或特殊种质材料。空间诱变育种集航天技术、生物技术和农林业育种技术为一体,育种的诱变源非常丰富,并且是在地面上无法模拟的,它对植物种子引起的变异是多方面的。目前植物的空间有变育种较多采用分子标记手段，旨在阐明突变所涉及的分子遗传基础，克服经典遗传学研究中的遗传标记太少,很难对突变体进行有效分析的困难;克服因这些形态特征和遗传标记过于简单,由其推测生物的遗传基础的不可靠性。张文利等通过对神舟3号飞船搭载的树莓试管苗超微结构及其RAPD分析的研究表明,树莓试管苗经空间飞行后出现RAPD扩增多态性,从而说明,空间条件有可能导致植物DNA水平上的变化,产生可遗传的有益