植物基因工程操作论文

瓜叶菊Mlo基因片段的克隆摘要瓜叶菊（PericallishybridaB.Nord.）是菊科（Compositea）多年生草本植物，是元旦、春节重要的观赏盆栽早春花卉，具有广阔的开发前景和现实意义。近年来，白粉病（PowderyMildew）逐渐成为制约瓜叶菊商品化产业发展的重要病害之一。瓜叶菊白粉病的传统生物防治方法不仅使病原产生抗药性，还会造成成本增加和环境污染等问题。因此，利用基因工程手段培育具有广谱抗白粉病的瓜叶菊种质资源具有非常重要的意义。Mlo基因是一种新型的抗病基因，可能参与瓜叶菊白粉病的调控过程。它与显性R基因控制的抗病基因不同，它是由单基因控制的隐性抗病基因，具有非小种专化的持久抗性，其功能类似于G蛋白偶联受体。Mlo基因可能对细胞坏死具有负调控作用，即抑制细胞坏死，类似于其它突变体基因以寄主死亡来抵抗病原菌的入侵，Mlo基因突变为mlo基因后，对细胞死亡的负调控作用被解除，被侵染细胞可能更易死亡，由此引发广谱的抗病性。任何感病的野生型都可以通过对Mlo基因进行诱变而获得抗性。这种抗性，即便是在粗放的栽培管理条件下，也可以在田间得到持久保存，即便没有病原菌的侵染，突变的mlo植物也表现出自身细胞壁加固（cellwallappositions，CWAs）和叶细胞的自发死亡现象。因此，对该基因的克隆以及结构和功能的研究，为瓜叶菊的抗病育种奠定了基础并提供了新思路。本研究以瓜叶菊（PericallishybridaB.Nord.）为试材，通过PCR方法克隆了Mlo基因片段的cDNA序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo基因的功能和表达情况提供了理论依据。关键词:瓜叶菊；Mlo基因片段；PCR扩增；1.研究的目的及意义在温室生产的条件下，白粉病（PowderyMildew）逐渐成为瓜叶菊（PericallishybridaB.Nord.）栽培的主要病害，发病后严重影响瓜叶菊的生长发育和观赏性能，随着元旦、春节人们对于盆栽早春瓜叶菊需求的逐年增加，目前瓜叶菊白粉病已成为制约瓜叶菊商品化产业发展的重要病害之一。迄今为止,化学杀菌剂的喷施是目前防控瓜叶菊白粉病的主要手段，但又往往损伤叶片和花朵，影响了观赏价值和带来环境污染[1]。在生产上，主要通过常规杂交选育的方法培育抗白粉病的瓜叶菊品种，可是由于白粉病原菌优势小种的更替及突变速度快，导致抗病选育往往落后于小种更替[2]。近年来，人们采用RNA干扰MLO(Mycoplasma-likeOrganism)基因技术进行白粉病的防治取得一定进展[3,4]，如果该技术应用于瓜叶菊白粉病的防治上，那么有望从根本上解决防控白粉病的问题。瓜叶菊白粉病的Mlo基因防治机理认识还不是十分清楚，但是在大麦、番茄等作物上有研究表明，作为一种新型抗病基因，Mlo基因会使植物产生叶细胞的自发死亡现象，且在抗性调控的过程中起负调控因子的作用[5,6]。即使没有病原菌存在时，携带mlo突变基因的大麦也易引发植物本身自发性的细胞坏死，说明在细胞坏死过程中，野生Mlo基因可能起负调控作用，即抑制细胞坏死[7,8]。通过缺失或移码的方式，Mlo基因突变成为mlo后，正常功能的MLO蛋白不能被合成，因此解除了这种负调控作用，而植物的叶表皮细胞会积累具有抗真菌活性功能的酚类物质以及H2O2和O2-，其中H2O2能够直接杀死感病细胞和侵染的病原菌，从而阻碍了白粉病的入侵，并加固细胞壁，产生广谱抗病性[9,10]。本实验以瓜叶菊（PericallishybridaB.Nord.）为试材，采用RT-PCR和RACE方法克隆了Mlo基因cDNA全长序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo基因的功能和获得具有广谱和持久的白粉菌抗性的瓜叶菊种质资源奠定基础。2材料与方法2.1实验材料2.1.1植物材料瓜叶菊（PericallishybridaB.Nord.）由东北农业大学园艺实验站提供，取样液氮速冻保存于-80℃冰箱中备用。2.1.2实验试剂TRIZOL购自Invitrogene公司；总RNA抽提试剂盒购自北京天根；第一链cDNA合成试剂盒，PCR扩增试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒均购于北京全式金公司，其它生化试剂均为进口或国产分析纯产品。2.1.3菌株及载体大肠杆菌（E.coli）菌株Trans5α、TransT1购置于北京全式金，克隆载体pMD18T-Vector购置于TaKaRa公司。2.2实验方法2.2.1瓜叶菊Mlo基因片段的克隆及序列预测分析2.2.1.1瓜叶菊RNA的提取方法一：TRIZOL法提取RNA（1）剪取100~200mg新鲜的瓜叶菊叶片，液氮研磨后，置入1.5ml离心管中，加入lm1预冷的TRNzolReagent试剂，振荡lmin，室温放置5~10min；（2）4℃，12000r/min，离心10min，去除沉淀；（3）取上清，并将其液移入一新的离心管，加入等体积的氯仿（1:1），剧烈振荡30sec，室温静置2~3min；（4）4℃，12000r/min，离心10min；样品分成三层：黄色有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新的离心管中；（5）加入等体积的异丙醇，室温沉淀10~30min；（6）4℃，12000r/min，离心10min，沉淀RNA；（7）去上清，加入lm175%的乙醇（DEPC处理过的水配制）清洗，4℃，7500r/min，离心5min；重复一次；室温晾干10min左右；（9）加入50μl无RNase的灭菌双蒸水（ddH2O），溶解RNA；（10）260mn下测OD值定量RNA浓度；方法二：参照北京天根总RNA抽提试剂盒说明书2.2.1.2设计简并引物将GeneBank上登录的外源植物Mlo基因的核苷酸及氨基酸序列进行下载，通过DNAMAN软件进行序列比对，根据比对结果为上下游引物确定两个合适的保守区域，使用primer5.0设计简并引物。2.2.1.3RT-PCR扩增目的片段参照北京全式金EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix,反转录试剂盒说明书。（1）瓜叶菊cDNA第一链的获得反转录反应体系如下：瓜叶菊RNA3ulAnchoredOligo(dT)18(0.5μg/μl)1ul2×TSReactionMix10ulTransScriptRT/RIEnzymeMix1ulRNase-FreeWaterto20ul反转录反应条件如下：42℃30min，85℃5min。（2）Mlo基因的PCR扩增PCR反应体系如下：TemplateDNA2ulForwardPrimer(10μM)1ulReversePrimer(10μM)1ul10×TransTapHiFiBuffer5ul2.5mMdNTPs4ulTransTapTMHiFiDNAPolymerase0.5ulddH2Otofinalvolum50ulPCR反应条件如下：94℃pause94℃3min94℃30s51℃1min35Cycles72℃1min72℃10min4℃pause反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，利用紫外凝胶成像系统进行拍照及分析，观察是否扩增出目的片段大小的条带。2.2.1.4凝胶回收目的片段按照TIANgelMidiPurificationKit（离心柱型）胶回收试剂盒说明书进行。（1）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min，弃收集管中的废液，然后把吸附柱放回收集管中。（2）DNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，紫外灯下从凝胶上将目的条带DNA切出放入干净的1.5mlEppendorf管中称取重量。（3）向胶块中加入3倍体积PN溶胶液（如凝胶重0.1g，其体积可视为100μl，依此类推），50℃水浴放置10min，期间不断上下翻转离心管，确保胶块的完全溶解。如果胶块没有完全溶解，可再加入些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块彻底融化。（4）将融化的胶溶液转移到一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心30~60s，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。（5）向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW。12000rpm，离心30~60s后，倒掉收集管中的废液。（6）将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm，离心2min，尽量去净漂洗液，将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。（7）将吸附柱CA2放入干净的离心管中，向吸附膜中央位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB（65~70℃预热后效果更好），室温放置2min。12000rpm，离心2min收集DNA溶液（洗脱液体积应不少于30μl）。回收DNA可立即使用或保存于-20℃备用。（8）1％琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。2.2.1.5PCR产物与T载体连接pMD18-TVector，在10μl连接体系中加入以下成分：表2-1连接反应体系Tab.2-1Thereactionsystemofconnect成分10μl/管PCR回收产物4ulpMD18-TVector1ulSolutionI5ul置于冰上操作，之后放于16℃反应过夜。2.2.1.6连接产物转化大肠杆菌感受态细胞（Trans5αChemicallyCompetentCell）购于TRANS。操作说明如下：（1）取感受态细胞100μl，置于冰上融化，加入10μlpMD18-TVector连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。（2）于42℃水浴中热激90s，之后迅速将管移到冰浴中2min，该过程不要剧烈摇动。（3）向每个离心管中加入500μl无菌的LB液体培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200r/min培养1h，使细菌复苏。（4）8000rpm离心5min，留50-100μl菌液，将感受态均匀涂开，将平板倒置于37℃培养箱中过夜。2.2.1.7重组质粒的PCR鉴定在25μl的PCR反应体系中，取模板为0.2μl的质粒cDNA或1μl的菌液，进行正常程序的PCR反应，同时设负对照，电泳检测是否扩增出特异条带。2.2.1.8重组质粒的酶切鉴定本实验中用HindIII单酶切、EcoRI单酶切和HindIII/EcoRI双酶切来对重组质粒进行酶切鉴定。观察电泳中DNA条带位置，来确定是否有外源片段的插入以及插入片段的大小是否正确，从而初步判断是否为重组克隆。然后将其送到华大基因进行测序。2.2.1.9序列分析将测序所得的序列利用生物学软件进行分析，并通过NCBI网站()对Mlo基因的序列信息进行解析。3结果与分析3.1瓜叶菊总RNA的提取及质量分析采用TRIZOL法和试剂盒提取瓜叶菊叶片总RNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。从图3-1可以清晰地看到28S和18S两条主带，5s条带亮度也较弱，说明提取的总RNA纯度较高，无明显降解，其完整性符合试验要求，可用于进行下一步反应。图3-1瓜叶菊叶片总RNA3.2Mlo基因保守序列的克隆3.2.1简并引物的设计在GenBank上搜索外源Mlo基因的氨基酸序列，以番茄、辣椒、芜菁、拟南芥等植物为参考，使用DNAMAN软件对其氨基酸序列进行比对，结果发现该基因保守性较高，根据比对结果为上下游引物确定两个合适的保守区域，使用primer5.0设计简并引物。克隆瓜叶菊Mlo基因保守序列，简并引物序列为：F:5’-CAYCARCTGCAYATHTTCAT-3’R:5’-GGVAGAGTCACATAGCTGCA-3’3.2.2RT-PCR扩增Mlo基因目的片段以瓜叶菊总RNA反转录所得到的第一链cDNA为模板，PCR扩增目的片段，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现约在812bp处有一条亮带，与目的片断的大小一致（图3-2），初步推测该扩增产物为Mlo基因目的片断，并有待进一步鉴定。图3-2Mlo基因的RT-PCR扩增电泳图M：DL2000；1：Mlo基因