植物组织培养复习大纲

绪论（一）植物组织培养的基本概念植物组织培养（planttissueculture）：在无菌条件下，利用人工培养基，对植物材料（器官、组织、细胞或原生质体等）的离体培养。外植体（explant）：接入培养基，以进行离体培养的植物材料。接种（inoculate）：在无菌条件下，将外植体接入培养基，以进行培养的操作。初代培养：对从植物体上分离下来的外植体，进行的最初培养，其目的是建立无菌培养系。继代培养：将初代培养诱导产生的培养物，重新分割，转到新鲜培养基上，继续进行的培养。脱分化（dedifferentiation）：细胞由成熟状态转变为分生状态的过程。愈伤组织（callus）：无定形、具有分生能力而无特定功能的一团无序生长的薄壁细胞。植物细胞全能性（plantcelltotipotency）：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息，和发育成完整植株的潜在能力。（二）植物组织培养的发展简史1、探索阶段（20世纪初~20世纪30年代中）20世纪初，德国植物生理学家Haberlandt：小野芝麻和凤眼兰栅栏组织的单个细胞／虎眼万年青属的表皮细胞的单个细胞；Knop＋蔗糖；→细胞生长、胞壁加厚、淀粉形成；≯细胞分裂：？①高度分化的细胞；②未加植物生长物质的简单培养基。＝植物组织培养的先驱者植物组织培养的先驱者2、奠基阶段（20世纪30年代中~50年代末）20世纪30年代中，对植物生长的两个重要发现：①B族维生素；②生长素。1934年，美国科学家White：番茄根尖；培养基（原来）：无机盐＋酵母浸出液＋蔗糖；（后来）：无机盐＋B族维生素（吡哆醇、硫胺素、烟酸）＋蔗糖；→建立了第一个活跃生长的无性系；White培养基。1934年，法国科学家Gautheret：山毛柳和黑杨等的形成层组织；Knop＋盐酸半胱氨酸＋葡萄糖；（胡萝卜根形成层）＋B族维生素＋生长素；首次获得连续生长的组织培养物。1934年，Nobecourt：胡萝卜；也建立了类似的连续生长的组织培养物。Gautheret、White和Nobecourt：植物组织培养的奠基人20世纪40年代~50年代初，Skoog（1944）；Skoog和崔徵（1951）：腺嘌呤不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素的对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成。确立了：腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。导致了激动素的发现以及利用激动素和生长素在植物组织培养中控制器官分化研究工作的开展。1941年，Overbeeketal：将椰子汁加入培养基：曼陀罗的心型期幼胚离体培养成熟。1952年，Morel和Martin：对已被病毒侵染的大丽花茎尖分生组织进行离体培养：获得脱毒植株.1953年，Muir：将万寿菊和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中，于摇床上振荡，使组织散碎，形成由单细胞和细胞聚集体组成的细胞悬浮液，再经继代培养：→获得了单细胞培养的初步成功；还用机械方法由细胞悬浮液和易散碎的愈伤组织中分离得到单细胞，将其置于铺在愈伤组织上面的滤纸上培养：→细胞发生了分裂。此即“看护培养”技术。1955年，Milleretal：从鲱鱼中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，并将其定名为激动素（kinetin）。现将具与激动素类似活性的天然的或合成的一类化合物统称为细胞分裂素。1957年，Skoog和Miller：提出了有关植物生长物质控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基中这两类植物生长物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根；这一比率低时促进茎芽的分化；二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长。后来证明：植物生长物质可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些植物生长物质的内生水平不同。因而，对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源植物生长物质的水平也会有所不同。1958年，Stewardetal：以胡萝卜为材料，首次通过实验证实了先驱者Haberlandt关于细胞全能性的设想，成为植物组织培养研究历史中的一个里程碑。1958年，Reinert和Steward分别报道：在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道，很多物种都能形成体细胞胚。3、迅速发展阶段（20世纪60年代~现在）（1）原生质体培养取得重大突破：1960年，Cockingetal用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功；1971年，Takebeetal在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除生殖细胞和有壁体细胞以外，体细胞的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可为基因工程外源基因的导入提供理想的受体材料；1972年，Carlsonetal通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。（2）花药培养取得显著成绩：1964年，GuhaandMaheshwari报道，在毛曼陀罗中通过花药离体培养由小孢子直接发育成胚；1967年，BourginandNitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。（3）微繁技术得到广泛应用：1960年，Morel建立了一个离体营养繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。由于这一方法具巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”。在其它许多观赏植物和经济植物中，微繁也达到了工厂化的生产规模。1962年，Murashinge和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。（三）植物组织培养与其它生命科学的关系1、植物组织培养是植物基因工程不可或缺的组成部分。无论是转基因受体的提供，还是转化细胞的筛选和再生，都需组织培养技术作为支撑。2、植物组织培养是生物制品的有效生产途径。有些极其昂贵的生物制品，例如抗癌首选药物——紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。国内在红豆杉组织培养中获得高产细胞系，每L细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。3、在植物杂交育种中，采用花药培养技术不但可以缩短杂合体纯合化所需的时间，而且还可节省土地面积。4、在远缘杂交中，通过原生质体融合可克服受精前障碍；通过幼龄合子胚培养可克服受精后障碍；通过原生质体融合可获得细胞质杂种。5、对于无药可治的病毒病，可通过茎尖培养消除病毒。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等。6、通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可进行很多名贵花卉等重要园艺植物的快速繁殖。一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如：一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。7、应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化，从而大大提高选择效率，节省时间和土地面积，且不受季节的限制。例如：中国林科院通过逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。8、愈伤组织培养等可产生体细胞无性系变异，为不同的育种目标提供（除有性杂交、理化诱变外的第三类）可利用的变异。9、特别在营养繁殖植物中，通过茎尖分生组织等离体材料的超低温保存，不但可大大节省空间，而且可使其免受病虫侵袭，且便于无毒种质的国际交流。二、实验室的基本分区及设备（一）概述如果新建实验室，那么最好应选择在光线充足、通风良好、空气清新、环境清洁、水电齐备、交通便利的地方，注意避开各种污染源。也可因地制宜利用现有房舍，按照相关要求改建而成。实验室的大小可根据各自的工作性质和生产规模来设计，面积可大可小。如用于科研和小规模生产的，面积可较小；如为大规模工厂化生产的，面积应较大，其常被称为“组培工厂”。一个大型的植物组织培养实验室可设置：洗涤室、药品室、称量室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、观察记录室、贮藏室，另外还可配置一定面积的炼苗温室。小型植物组织培养实验室可将上述同类分区加以合并。如果条件允许，那么其可分为准备室、接种室、培养室、炼苗室等区室。一般按照自然工作程序，将上述各区室依次安排成一条连续的生产线。①洗涤室：用于玻璃器皿、实验用具的清洗干燥；培养材料清洗及预处理也可在本室完成。②药品室：用于存放各种药品试剂。要求：干燥、通风，避免光照。③称量室：进行化学药品的称量。要求：干燥、密闭、无直射光照，避免腐蚀性药品与水汽直接接触。④培养基配制室：主要进行贮备液和植物生长物质原液的配制以及培养基的配制、分装、包扎及灭菌前的暂时存放。⑤灭菌室：主要用于培养基和器皿的灭菌以及蒸馏水的制备。⑥接种室：主要进行植物材料的表面灭菌、分离切割及转接等。面积：宜小不宜大，一般小的接种室为5~7m2。要求：地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉门，以减少开关门时的空气扰动。在适当位置吊装1~2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。接种室外应设有缓冲间，面积以1m2为宜。进入接种室前在此更衣换鞋，以减少进出时将杂菌带入接种室。缓冲间最好也装一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。⑦培养室：培养植物材料的场所。室内的培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约10cm，其它每层间隔30cm左右，整个培养架高约1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计的，宽度一般为60cm。培养室内各因子设置（培养的物理条件）：培养室中对培养影响最大的因子是温度。为适合大多数植物生长，一般通过冷热可控空调，通常将温度设定为25±2℃。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，因此最好不同种类有不同温度的培养室。室内湿度也应维持恒定，一般相对湿度以保持在70%~80%为宜，可通过加湿器、除湿器来调节。光照强度：对多数植物来说，1000~4000lx的光强即能满足其生长的需要。光周期：可通过定时开关控制。一般设为每天光照10~16h。通常短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。也有一些培养类型需要连续黑暗。黑暗条件：利于愈伤组织的诱导和增殖、再生器官原基的分化等；光照条件：利于器官增殖发育等。光质：对愈伤组织的诱导、培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。例如：百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织；但在蓝光下培养，十几周后才出现愈伤组织。而唐菖蒲子球块接种15d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛；而白光下幼苗纤细。对于杨树愈伤组织生长：红光促进；蓝光阻碍。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源。这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，炼苗容易成活。在阴雨天可用灯光作补充。⑧观察、记录室：用于对培养物的生长情况及实验结果进行观察记录。⑨贮藏室：用于暂时不用的器皿和用具等的存放。⑩炼苗室：用于试管苗的炼苗和移栽。（二）基本分区及其设备1、准备室及其设备主要用于：器皿洗涤、干燥、贮存；试剂贮存、称量、配制；培养基配制、分装、灭菌等。主要设备有：洗涤池、烘箱、药品柜、冰箱、工作台、天平、蒸馏水发生器等制水设备、贮物柜、三角瓶、电热磁搅拌器、pH计、电炉、微波炉等加热设备（熔化琼脂等）、恒温水浴、培养基分装器、培养容器等各种所需器皿及用具、封口材料、医用小推车等运输工具、高压蒸汽灭菌锅（小型手提式或中型立式或大型卧式）、吸气机或真空泵（辅助过滤灭菌）、细菌过滤器、离心机、血球计数器、显微镜等。注意要点：电子分析天平和托盘天平：电子分析天平用于称取大量元素、微量元素、维生素、植物生长物质等微量药品，精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。注意要点：pH计：组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用pH计测定。若无pH计，也可使用pH试纸进行粗测。首次使用pH计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH值计上的温度扭，使之与培养基温度相当。注意要点：高压蒸汽灭菌锅：用于耐热培养基、蒸馏水和接种器械等