植物蛋白质粗提实例

白果蛋白质提取及SDS-PAGE分析李莹莹，吴彩娥，杨剑婷，贾韶千，徐文斌，彭方仁材料与方法1.1材料与试剂白果：品种为泰兴大佛指，购自江苏泰兴市。白果去掉外种皮后于0～4℃贮藏。SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。1.2仪器与设备TU-1800PC紫外分光光度计北京普析通用容器有限责任公司；DYY-6C型电泳仪北京六一仪器厂；电泳自动成像仪美国BIO-RAD生化科技有限公司；PHS-2C型数显pH计上海智光仪器仪表有限公司；GL-20G-II型冷冻离心机上海安亭科学仪器厂。1.3原料处理及蛋白质提取1.3.1原料处理冻干处理：新鲜白果于－20℃真空冷冻干燥，研磨过筛，石油醚脱脂；烘干处理：新鲜白果于30℃烘箱中烘烤12h，研磨过筛，石油醚脱脂；对照：去掉外种皮后于0～4℃贮藏的白果。1.3.2白果蛋白质提取1.3.2.1Tris-HCl法参照谷瑞升等[7]的方法。取脱脂后3种样品各1g，加入10mL的0.2mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)，4℃浸提6h后于4℃、4000r/min离心15min，取上清液测定蛋白质含量。1.3.2.2盐溶法参照黄文等[5]的方法。取脱脂后3种样品各1g，加入10mL的0.14mol/LNaCl溶液，4℃浸提6h后在4℃、4000r/min离心15min，取上清液测定蛋白质含量。1.3.2.3磷酸缓冲液提取法取脱脂后3种样品各1g，加入10mL的0.05mol/LpH8.0磷酸缓冲液(含0.1mol/LKCl、2mmol/LEDTA)，4℃浸提6h后4℃、4000r/min离心15min，取上清液测定蛋白质含量。蓖麻籽蛋白质粗的分离狄建军、袁绍辉、王云、魏永春、黄凤兰、谢寇龙主要仪器高速冷冻离心机，珠海黑马医学仪器有限公司DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂精密pH计，上海精密科学仪器有限公司电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司SHA-B数显恒温振荡器，常州国华电器有限公司T6新世纪紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司蓖麻籽粗蛋白提取方法的优化从超低温冰箱中取出去壳的蓖麻籽适量，放入冷冻好的研钵中迅速研磨。充分研磨后称取8.0g放入50ml的离心管中，加入5mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.5，含100mmol/LNaCl,缓冲液A）32ml，并充分混匀，4℃放置过夜。4℃、14000r/min离心30min，小心去除沉淀和白色脂肪，取上清于另一离心管中，相同条件下重复离心一次。取7个1.5ml的离心管，将所得上清液各取1000μl，分别加入不同质量的固体硫酸铵，使各管的硫酸铵浓度依次为30％、40％、50/％、60％、70％、80％、90，4℃放置过夜。4℃/17000r/min离心30min，弃上清，取500μl缓冲液A将沉淀溶解。罗汉果蛋白酶的分离纯化及性质研究刘国雄TrisAugusCMSepharoseFFAmershamPhameciaBiotechSepahcrylS-200HRAmershamPhameciaBiotechSepahcrylS-100HRAmershamPhameciaBiotechShim-packDIOL-300柱天津市先明科技发展有限公司透析袋（DM-22，12-14KD）华美生物工程公司Waters2487双波长紫外检测仪WatersUV2401紫外分光光度计Shimadzu一、罗汉果粗酶的制备将鲜罗汉果洗净，去皮，加入3体积的0.05mol/L的Tris-HCl（pH7）缓冲液（含1mmol/LEDTA），用组织绞碎机粉碎，匀浆，冷冻离心（8000r/min，4℃）10分钟，取上清液得罗汉果汁。取适量罗汉果汁，边搅拌边缓慢加入固体硫酸铵到饱和度为50%，静置2h，冷冻离心（8000r/min，4℃）10分钟，取沉淀，用适量的0.05mmol/LTris-HCl（pH7）缓冲液（含1mmol/LEDTA）溶解，再用上述缓冲液透析过夜至用1%的BaCl2溶液检测不到沉淀为止(不时换缓冲液2-3次)，冷冻干燥得罗汉果粗酶。二、罗汉果蛋白酶的CMSepharoseFF柱层析取4g粗酶溶于15mL0.05mmol/LHAc-NaAc(pH4.3)缓冲溶液中，过滤出去不溶性蛋白，上样于已用0.05mmol/LHAc-NaAc(pH4.3)缓冲溶液平衡的CMSepharoseFF阳离子交换柱(2.6×70cm)，再用上述缓冲液洗涤杂蛋白，到洗脱液在280nm的紫外吸收低于0.02为止，再用0.05mmol/L–1mmol/LHAc-NaAc(pH4.3)缓冲溶液连续梯度洗脱，总洗脱体积为4300mL，流速为1mL/min，280nm紫外吸光检测，记录，11mL/管收集蛋白酶活性峰，0.05mol/L的Tris-HCl（pH7）缓冲液（含1mmol/LEDTA）透析过夜除盐，所得溶液经冷冻干燥，得罗汉果蛋白酶样品。三、罗汉果蛋白酶的SepahcrylS-200HR柱层析将CMSepharoseFF柱层析所得的蛋白酶样品溶于5mL0.15mol/LHAC-NH4AC缓冲液（pH6.5），再上样于已用上述缓冲溶液平衡的SepahcrylS-200HR凝胶柱(2.6×70cm)，用初始缓冲液以0.6mL/min流速洗脱，280nm紫外吸光检测，记录，6mL/管收集蛋白峰，0.05mol/L的Tris-HCl（pH7）缓冲液（含1mmol/LEDTA）透析过夜，所得酶液经冷冻干燥，得罗汉果蛋白酶样品。四、罗汉果蛋白酶的SepahcrylS-100HR柱层析将SepahcrylS-200HR柱层析所得蛋白酶溶于1.5mL0.15mol/LHAC-NH4AC缓冲液（pH6.5），再上样于已用上述缓冲溶液平衡的SepahcrylS-100HR凝胶柱(1.6×80cm)，用初始缓冲液以0.6mL/min流速洗脱，280nm紫外吸光检测，记录，每管5mL收集蛋白峰，0.05mol/L的Tris-HCl（pH7）缓冲液（含1mmol/LEDTA）透析过夜，所得溶液经冷冻干燥，得纯化的罗汉果蛋白酶。玉米总蛋白质提取技术和蛋白质样品浓度测定方法的比较杨文鹏王明春杨留启王伟总蛋白质提取方法（1）磷酸缓冲液(PB)法：取蛋白质提取液[1MKH2PO4+K2PO4，可于用前现加入1mMPMSF(L苯甲基磺酰氟)]3.5ml加入5ml离心管中，置于冰上。称取1g组织样品放在研钵中用液氮研磨，然后转入离心管中混匀，冰上静置3～4h。4℃条件下离心，15000r/min，45min。提取上清液，再离心1次，取上清，4℃保存备用或-80℃保存。（2）Tris法：制备蛋白质提取液[1MTrisHCl(pH8.0)，15ml甘油，25ml聚乙烯吡咯烷酮，（PVP)，2g；加超纯水定容至100ml]。取3.5ml(可调)加入5ml离心管，置于冰上。称取1g组织样品放在研钵中用液氮研磨，之后转入离心管中混匀，在冰上静置3～4h。4℃条件下离心，15000r/min，45min。提取上清液，再离心1次，取上清，4℃保存备用或-80℃保存。（3）改进Tris法：将上述Tris法改进为：取3.5ml(可调)蛋白质提取液(同(2))加入5ml离心管，置于冰上预冷。称取1g组织样品放入研钵中，用液氮研磨成粉末，再加入预冷提取液冰浴研磨成浆，之后转入5ml离心管中混匀，在冰上静置4ｈ至过夜。4℃条件下离心，15000r/min，45min。提取上清液，再离心1次，取上清，4℃保存备用或-80℃保存。(5）试剂盒法:按PlantTotalProteinExtractionKit(Sigma-Aldrich,PE0230)说明操作。(6)试剂盒改良法:在甲醇中不加蛋白酶抑制剂混合物而改加1mM的PMSF，裂解液用LYSISbufferA，而不用Type2WorkingSolution溶液，其余与PlantTotalProteinExtractionKit说明相同。