槐花药材的含量测定及方法学验证实验报告

槐花药材的含量测定及方法学验证姓名：廖卓*学号:11071105一、实验目的1、掌握比色法测定槐花药材中总黄酮含量的方法及原理。2、熟悉槐花药材的含量测定的方法学验证。二、实验原理槐花为豆科植物SophorajaponicaL的干燥花及花蕾[1]。夏季花开放或花蕾形成时采收，及时干燥，除去枝，梗及杂质。前者习称“槐花”，后者习称“槐米”。槐花药材的主要有效成份是黄酮类化合物，其中芦丁的含量最高，所以槐花药材的鉴别及含量测定均以芦丁为指标成分。芦丁（C27H30O16,610.51）黄酮类化合物在碱性条件下与铝盐发生配位反应，生成红色的配位化合物，使得最大吸收波长红移至可见光区，且具有较高的吸收系数。黄酮类与铝盐的配位反应是定量完成的，因此可采用比色法测定槐花药材中总黄酮的含量，避免其他非黄酮成分对测定准确度的影响[2]。三、仪器与试药仪器：紫外—可见分光光度计,100ml容量瓶，25ml容量瓶、10ml移液管，超声波清洗器、漏斗、玻璃棒试剂：槐花药材，芦丁对照品，5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，氢氧化钠试液，乙醇。四、实验步骤总黄酮含量测定（1）对照品溶液的制备：取芦丁对照品50mg，精密称定，置于25ml量瓶中，加60%乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀。精密量取10ml,置于100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得浓度为0.2mg/ml的芦丁对照品溶液。（2）检测波长的选择：取A对照品溶液，在400～600nm波长进行光谱扫描，发现光谱图最大吸收，选定波长说明：一般选择待测样品化合物吸收度最大，即吸收曲线最高点为测定波长。化合物的最大吸收峰λmax或该化合物经显色后的最大吸收峰，通过分光光度计进行扫描后确定或通过二极管阵列检测来确定，并与该化合物文献值相比较应一致。在最大吸收峰处测定时灵敏度高，误差小。因此一般情况下选择最大吸收波长作为检测波长。（3）标准曲线的制备：配制不同浓度的A对照品溶液，考察线进样量与峰面积的性关系、线性范围、相关系数等。以进样量为横坐标峰面积为纵坐标做标准曲线：标准曲线的制备步骤：精密量取对照品溶液1ml,2ml,3ml,4ml,5ml与6ml，分别置于6个25ml量瓶中，各加水使成6.0ml，精密加5%亚硝酸钠溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，再加10%硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10.0ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟，不加对照品溶液同法配制空白溶液，按照紫外可见分光光度法，在500nm波长处测定各溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。浓度C（mg/ml）0.0000.0080.0160.0240.0320.0400.048吸光度A（4）、供试品溶液的制备：将槐花研碎，取粗粉约1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加60%乙醇120ml，60°C超声30分钟，摇匀，过滤，取续滤液10ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。（5）、测定法：精密量取供试品溶液3ml，置25ml量瓶中，按照标准曲线制备项下方法，自“加水使成6.0ml”起同法测定吸光度，由标准曲线计算出供试品溶液中含芦丁的重量。槐花按干燥品计算，含总黄酮以芦丁（C27H30O16）计，槐花不得少于8.0%，槐米不得少于20.0%。样品浓度C（mg/ml）123平均值吸光度A—浓度C（mg/ml）—百分含量（%）五、方法学考察1、加样回收试验：一般回收率要求在95.0～105.0％。详解：加样回收试验即于已知被测成分含量的成药中再精密加入一定量的被测成分纯品，依法测定。用实测值与原样品中含测成分之差，除以加入纯品量计算回收率。此法不用制备空白对照，模拟真实性好。加样回收试验操作方法：取样品6份精密称定每份0.5g，精密加入芦丁对照品适，同按照供试品溶液的制备法和测定法步骤在500nm波长处测定各浓度的吸光度，计算含量。%100%加入对照品含量实验前样品含量实验测得量回收率注意事项：（1）、纯品的加人量与取样量中被测成分之和必须在标淮曲线线性关系范围之内；（2）、外加纯品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。（3）、一般加入量与所取样品含量之比控制在1：1左右。（4）、做加样试验时，有人将对照品加至制备好的供试品溶液中，这是不对的，这样不能考察提取、纯化过程中被测成分是否损失，不能代表含量测定方法的回收率。因此要在称样开始时就加入对照品！分组吸光度加入对照品实验前样实验测得样回收率%平均回收率%（A）含量/mg品含量/mg品含量/mg1234562、精密度试验：是指用相同方法对同一样品溶液进行多次测定，考察各测定值彼此接近的程度。具体如下：取同一样品，连续测定五次，相对标准偏差RSD％不得大于3.0％。具体如下：精密度试验操作方法：取同一槐花样品溶液5ml，在500nm处测吸光度，重复测定5次，算出RSD测试次数12345吸光度A3、重复性试验：是指在同一条件下对同一批样品，从样品供试品液制备始，制备多份供试品溶液。每份供试品液再分别进行测定，测定所得到的数据进行统计学处理，计算其含量的平均值和相对标准偏差（RSD%）。具体如下：同一批号样品，分别取低、中、高三个样品量，每个样品量3份，按样品测定方法操作。或在规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价。相对标准偏差RSD％不得大于2.0％。重复性实验操作方法：精密称取药材样品1g，精密称定，共6份，按供试品制备方法制成供试品溶液按测定法分别在500nm波长处测定各溶液的吸光度。由标准曲线计算出供试品溶液中含芦丁的重量（ug）并求RSD值。样品123456吸光度A含量（ug）4、稳定性试验：考察不同时间点是否对测定方法和测定结果有影响，用同一被测样品的供试液在不同间隔时间用同一测定方法所得到的测定结果。一般考察36小时，这里考察60min计算RSD%不得大于3.0％。对照和样品均要做.稳定性实验操作方法：取芦丁对照品和样品溶液5ml，于0，15，30，45，60min，测定吸光值，计算吸光度平均值，求出RSD，判断样品的稳定性。时间（min）015304560平均值吸光度A六、总结七、注意事项(1)比色法中显色反应及条件对形成的稳定配位化合物有一定影响，因此实验中需要遵守平行操作原则：如配置标准系列溶液时，空白与标准系列溶液中加入各种反应试剂的量、顺序、反应时间与温度等操作步骤均应保证平行；所有加入的反应试剂均应使用刻度吸量管精密量取，准确加入。(2)注意吸收池（比色皿）的配比使用。八、附录1.实验试剂配制（1）5%亚硝酸钠溶液:取2.5g亚硝酸钠，加水溶解成50ml,摇匀即得。（2）10％硝酸铝溶液：取5.0g硝酸铝，加水溶解成50ml,摇匀即得。（3）氢氧化钠试液：取氢氧化钠8.6g，加水溶成200ml，即得。[参考文献][1]中国药典.一部[s].2010:333.[2]范国荣，槐花药材中总黄酮的质量分析.药物分析实验指导2011.11