基因捕获

什么是基因陷阱或基因捕获（genetrap）？基因陷阱或基因捕获（genetrap）是通过在基因组中创造随机插入突变，来直接获得分子特征。基因陷阱或基因捕获载体包含一个无启动子的报告基因或选择标记，它能在插入位置（内含子）激活所在基因表达。因这系列方法酷似以报道基因为诱饵来捕获基因，故得名基因陷阱或基因捕获。换言之，它主要依靠报告基因的随机插入来产生融合转录物或融合蛋白，通过检测报道基因而推知基因及其功能。一般常用的报道基因有GUS、绿色荧光蛋白（GFP）、Lc基因。在此基础上，还发展了启动子陷阱或启动子捕获（promotertrap）与增强子陷阱或增强子捕获（enhancertrap）。启动子陷阱或启动子捕获是通过将报道基因插入到细胞基因组的外显子上，如果发现它与细胞基因组基因被共同转录或表达，则可推知该报道基因附近有启动子。增强子陷阱或增强子捕获是将某报道基因与一个精巧的启动子相连，组成增强子陷阱重组体，它不会自主起始转录，需要由被插入的细胞基因组中的增强子帮助才可转录。若报道基因得以表达，则可推知插入位点附近有增强子或有基因。图1：在被“捕获”基因的启动子的转录控制下，报告基因与插入位置的内源基因整合。融合的转录体由上游外显子和报告基因组成。在载体中，多聚腺苷酸信号限制到内源转录单位的最后一个外显子。通常采用外显子陷阱和内含了陷阱两类。内含子陷阱包括一个剪接接受子序列（spliceacceptor，SA）（在无启动子报告基因最上游）。外显子陷阱没有剪接接受子序列，在插入外显子后激活报告基因表达。（Figure1.Integrationwithinanendogenousgeneplacesthereportergeneunderthetranscriptionalcontrolofthetrappedgene'spromoter.Afusiontranscriptisgeneratedbetweenupstreamexonsandthereportergene.Thepolyadenylationsignal(pA)withinthevectordefinesthefinalexonoftheendogenoustranscriptionunit.Twotypesofvectorsarecommonlyused,eachofwhichcanbeintroducedbyelectroporationorretroviralinfection.Theintrontrapincludesaspliceacceptorsequenceimmediatelyupstreamofapromoterlessreportergenethatisactivatedfollowinginsertionsinintronsofgenes.Theexontraplacksaspliceacceptorandisdesignedtoactivatethereporterfollowinginsertionsinexons.）更多的信息参阅国际基因陷阱或基因捕获联合会（IGTC,InternationalGene-TrapConsortium）网站：基因陷阱或基因捕获有什么特点、优势和劣势？基因陷阱和启动子陷阱都有位置限制。基因陷阱重组体由报道基因和剪接接受子或部位（spliceacceptor，SA）组成（接受体剪接部位在报道基因上游），该重组体需要插入到细胞基因组的内含子中随着基因转录和表达。如能检测到融合转录物或融合蛋白，就可证明插入位置附近有基因存在。启动子陷阱或启动子捕获需插入到内含子。因为增强子的作用特点，其位置与基因的位置可近可远，所以增强子陷阱不易定位基因。另外，对启动子陷阱和基因陷阱而言，插入可能导致基因失活。基因陷阱的优势在于它只在表达水平上定位基因，细胞基因本身的转录和表达不受影响，所以可检测功能上多余的基因，也可检测在基因表达多个水平上都有作用的基因，或低水平表达的重要基因，而以前的功能基因组学的方法如因表达的系统分析（SAGE）、cDNA微阵列、蛋白组技术、基因芯片、基于转座子标签和T2DNA标签的反向遗传学技术等对这些基因都是无法确定的。基因陷阱或基因捕获（genetrap）劣势包括：①达基因的确定较困难且耗时长。如何克隆和筛选融合转录物或融合蛋白是一件很费时费力的事。通常根据所插入的报道基因的DNA序列为引物，用PCR技术获取两侧序列，再与EST数据库比较和确定基因功能。最近出现一些很好的解决方法，如在RACE的微透析和固相测序中采用自动化和荧光测序，可缩短时间；或只测一小段DNA序列即与EST数据库已有序列进行比较，若已有人研究过，则不用继续，若从没研究过，则应得到目的基因全长并分析其功能。②突变的细胞的表型不明显——主要原因是被捕获的基因不一定有很明显的表达方式，以及突变的ES细胞克隆不一定有明显的表型。目前的解决方法是进行体外预先筛选我们需要的融合基因株系。③报道基因表型可能会丧失——若报道基因没按预期加以整合，或报道基因被剪接时整个被切除，都可能使报道基因表型丧失而无从着手。④目前使用的基因陷阱系统对细胞的伤害大——毕竟基因陷阱是插入了一段外源DNA，所以是一种剧烈的方法，会有致死效应（美国加州大学Berkeley分校的实验室的细胞或胚胎致死频率是1/3)。在一些情况下应采用柔和一些的方法，如进行重组体的置换而不是插入，用点突变，选择性地采用表型突变。更多的信息参阅国际基因陷阱或基因捕获联合会（IGTC,InternationalGene-TrapConsortium）网站：